作者littlelizard (專注)
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標題[求救] 請問比較不同誘導時間蛋白質表現量的方法
時間Sun Apr 19 19:00:09 2009
大家好
最近我在生產異源蛋白質
用 flask 培養
想要比較不同誘導時間蛋白質產量的高低
去找出最適合的誘導時間來得到最高產量的蛋白質
目前用的方式是
跑 SDS-PAGE 以及 Western Blot
實驗的方法是每 24 h 取樣一次
將菌體離下後取上清液裝在eppendorf
然後取一些 sample 加適量的 dye 之後 100度C 10 min 將蛋白denature
冷卻後冰 -20度C 儲存
等 sample 數足夠之後一起跑 SDS-PAGE
這樣的做法是為了讓不同誘導時間的 sample 跑在同一片 PAGE 上
方便我比較 band 的粗細 來大約看一下產量多寡
但是冰久了 or 因為反覆拿出的關係
protein 似乎因為降解造成我同一個 sample 在不同一片 PAGE上的量不一樣
冰越久的似乎降解越嚴重 然後 band 都糊糊的 有 smear 的感覺
所以想請問大家
有沒有比較好的解決方法?
或者是其他快速的測定方法
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.74.19
1F：推 bider:調整成 收的時間點一樣 前72hr 48hr 24hr加 04/19 19:09
2F：→ littlelizard:抱歉 不了解樓上意思耶@@ 04/19 19:57
3F：推 hwafun:我猜一樓應該想說調整成 不同時間養菌 但同個時間收菌 04/19 20:15
4F：推 saviora:sample分裝吧 04/19 20:26
5F：→ littlelizard:照3樓的說法 那接種菌量要一樣吧? 測OD嗎? 會準嗎? 04/19 20:41
6F：→ littlelizard:如果sample多的話還真是個大工程 04/19 20:42
7F：推 tsubasawolfy:為什麼不冰-80? 04/19 21:32
8F：→ littlelizard:是可以試試看樓上的方法 04/20 00:37
9F：→ littlelizard:謝謝大家的意見 我會再試試看 04/20 13:57
10F：推 mtdas:試試看加些 protein inhibitors, ex. PMSF 04/20 20:45
11F：→ mtdas: 我是要打 protease .. 04/20 20:55
12F：推 Fourfish:菌離心收下來直接冰 要跑SDS-PAGE在一起lysis 04/20 23:10
13F：→ littlelizard:恩 我會試一下PMSF 另外樓上的方法跟我的差在哪呢? 04/20 23:37
14F：→ littlelizard:是因為先denature反而容易degrade嗎? 04/20 23:38
15F：→ littlelizard:可否解釋一下? 謝謝喔~ 04/20 23:38
16F：推 bigcat24:未破菌先冰 因為膜未打破 有些酵素被包住而不會吃蛋白質 04/21 08:39
17F：推 timbrian:你sample在loading前要再煮一次 不然smear是因為SDS在冰 04/21 14:34
18F：→ timbrian:上沉澱析出所造成.. 04/21 14:35
19F：推 timbrian:看你敘述很明顯搞錯方向 protease沒強到denature還有活性 04/21 14:38
20F：→ mtdas:有可能是煮過後的sample被汙染 04/21 18:20
21F：→ littlelizard:我的是胞外蛋白 不破菌 只收上清液 04/21 21:07
22F：→ littlelizard:喔ˊ t大說的再加熱一次感覺很有道理 I'll try 感恩 04/21 21:09