作者littlelizard (专注)
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标题[求救] 请问比较不同诱导时间蛋白质表现量的方法
时间Sun Apr 19 19:00:09 2009
大家好
最近我在生产异源蛋白质
用 flask 培养
想要比较不同诱导时间蛋白质产量的高低
去找出最适合的诱导时间来得到最高产量的蛋白质
目前用的方式是
跑 SDS-PAGE 以及 Western Blot
实验的方法是每 24 h 取样一次
将菌体离下後取上清液装在eppendorf
然後取一些 sample 加适量的 dye 之後 100度C 10 min 将蛋白denature
冷却後冰 -20度C 储存
等 sample 数足够之後一起跑 SDS-PAGE
这样的做法是为了让不同诱导时间的 sample 跑在同一片 PAGE 上
方便我比较 band 的粗细 来大约看一下产量多寡
但是冰久了 or 因为反覆拿出的关系
protein 似乎因为降解造成我同一个 sample 在不同一片 PAGE上的量不一样
冰越久的似乎降解越严重 然後 band 都糊糊的 有 smear 的感觉
所以想请问大家
有没有比较好的解决方法?
或者是其他快速的测定方法
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.74.19
1F：推 bider:调整成 收的时间点一样 前72hr 48hr 24hr加 04/19 19:09
2F：→ littlelizard:抱歉 不了解楼上意思耶@@ 04/19 19:57
3F：推 hwafun:我猜一楼应该想说调整成 不同时间养菌 但同个时间收菌 04/19 20:15
4F：推 saviora:sample分装吧 04/19 20:26
5F：→ littlelizard:照3楼的说法 那接种菌量要一样吧? 测OD吗? 会准吗? 04/19 20:41
6F：→ littlelizard:如果sample多的话还真是个大工程 04/19 20:42
7F：推 tsubasawolfy:为什麽不冰-80? 04/19 21:32
8F：→ littlelizard:是可以试试看楼上的方法 04/20 00:37
9F：→ littlelizard:谢谢大家的意见 我会再试试看 04/20 13:57
10F：推 mtdas:试试看加些 protein inhibitors, ex. PMSF 04/20 20:45
11F：→ mtdas: 我是要打 protease .. 04/20 20:55
12F：推 Fourfish:菌离心收下来直接冰 要跑SDS-PAGE在一起lysis 04/20 23:10
13F：→ littlelizard:恩 我会试一下PMSF 另外楼上的方法跟我的差在哪呢? 04/20 23:37
14F：→ littlelizard:是因为先denature反而容易degrade吗? 04/20 23:38
15F：→ littlelizard:可否解释一下? 谢谢喔~ 04/20 23:38
16F：推 bigcat24:未破菌先冰 因为膜未打破 有些酵素被包住而不会吃蛋白质 04/21 08:39
17F：推 timbrian:你sample在loading前要再煮一次 不然smear是因为SDS在冰 04/21 14:34
18F：→ timbrian:上沉淀析出所造成.. 04/21 14:35
19F：推 timbrian:看你叙述很明显搞错方向 protease没强到denature还有活性 04/21 14:38
20F：→ mtdas:有可能是煮过後的sample被污染 04/21 18:20
21F：→ littlelizard:我的是胞外蛋白 不破菌 只收上清液 04/21 21:07
22F：→ littlelizard:喔ˊ t大说的再加热一次感觉很有道理 I'll try 感恩 04/21 21:09