※ 引述《monkey9841 (cc)》之銘言： : 想請問一下 : 1.我使用的transfer的膜是用PVDF膜(但我忘記廠牌了) : 那麼PVDF膜有正反面之分嗎 沒有~ : 因為 有時Transfer完後 當膜乾掉時 : 有時看的到protein 有時看不到 : 印象中學長姐都說膜沒有正反面之分 : 還是我看到protein只是運氣好呢? 有時候protein量(ug)太少也會看不太清楚 或transfer失敗當然也看不到 所以也要先確認transfer有無成功 : 2.有時transfer完後 當膜乾掉時 : 可以很明顯看到膜上有一大片泡泡 使protein沒法tran過去 確定是氣泡嗎? 請問您是用什麼方法tran呢?(溼or半乾式) 我之前tran"半乾式"有遇到過部分糊掉的狀況 有一種說法是壓上蓋施力不均或是太用力壓 : 我也有用玻棒趕氣泡耶 : 我都是先放膠 再蓋膜上去 然後用玻棒滾一滾 再蓋濾紙 還是有氣泡耶>< : 想請問 那如果先放膜 再把膠蓋上去 再蓋濾紙然後用玻棒滾一滾 會比較好嗎? 我覺得應該是沒差 雖然我的習慣是先放膜->gel 但我每放一層都會蓋一些bfr,再蓋下一層 蓋膜或是膠都由左往右放 利用bfr以及放置方向把氣泡往旁邊帶掉 －極 ╱ (gel) ╱ ╴╱ → ﹏﹏﹏﹏﹏ (transfer bfr) ————— (membrane) 　　　＋極 (3M paper在圖中忽略沒畫) 每層疊放時也會稍微看一下有沒有氣泡 特別是在蓋bfr後,氣泡會變得比較明顯 最後我也會趕氣泡(避免有沒看到的氣泡) : 3. 如果要收磷酸化的protein 好像聽說新鮮的會比較好 : 那是最久可以放多久呢? (這個我就沒做過了^^") : 4. 大家在收蛋白後 是否會把細胞上清液分裝成數管 : 每跑一次 只要拿一管出來解凍製備當檢品就好 : 還是其實可以不用分裝呢? 如果測的不是很容易degrade的蛋白 在收完細胞上清液後我都先測完濃度 ->加sample bfr稀釋整組樣品到固定濃度 ->煮95度->冰-20度 之後可以反覆loading數次SDS-PAGE都還OK 我是這樣做的 以上是我做western的一點小小經驗,若有錯誤觀念請指正~ 謝謝:) ※ 編輯: tinapig 來自: 123.110.26.146 (04/12 01:21)