※ 引述《monkey9841 (cc)》之铭言： : 想请问一下 : 1.我使用的transfer的膜是用PVDF膜(但我忘记厂牌了) : 那麽PVDF膜有正反面之分吗 没有~ : 因为 有时Transfer完後 当膜乾掉时 : 有时看的到protein 有时看不到 : 印象中学长姐都说膜没有正反面之分 : 还是我看到protein只是运气好呢? 有时候protein量(ug)太少也会看不太清楚 或transfer失败当然也看不到 所以也要先确认transfer有无成功 : 2.有时transfer完後 当膜乾掉时 : 可以很明显看到膜上有一大片泡泡 使protein没法tran过去 确定是气泡吗? 请问您是用什麽方法tran呢?(湿or半乾式) 我之前tran"半乾式"有遇到过部分糊掉的状况 有一种说法是压上盖施力不均或是太用力压 : 我也有用玻棒赶气泡耶 : 我都是先放胶 再盖膜上去 然後用玻棒滚一滚 再盖滤纸 还是有气泡耶>< : 想请问 那如果先放膜 再把胶盖上去 再盖滤纸然後用玻棒滚一滚 会比较好吗? 我觉得应该是没差 虽然我的习惯是先放膜->gel 但我每放一层都会盖一些bfr,再盖下一层 盖膜或是胶都由左往右放 利用bfr以及放置方向把气泡往旁边带掉 －极 ╱ (gel) ╱ ╴╱ → ﹏﹏﹏﹏﹏ (transfer bfr) ————— (membrane) 　　　＋极 (3M paper在图中忽略没画) 每层叠放时也会稍微看一下有没有气泡 特别是在盖bfr後,气泡会变得比较明显 最後我也会赶气泡(避免有没看到的气泡) : 3. 如果要收磷酸化的protein 好像听说新鲜的会比较好 : 那是最久可以放多久呢? (这个我就没做过了^^") : 4. 大家在收蛋白後 是否会把细胞上清液分装成数管 : 每跑一次 只要拿一管出来解冻制备当检品就好 : 还是其实可以不用分装呢? 如果测的不是很容易degrade的蛋白 在收完细胞上清液後我都先测完浓度 ->加sample bfr稀释整组样品到固定浓度 ->煮95度->冰-20度 之後可以反覆loading数次SDS-PAGE都还OK 我是这样做的 以上是我做western的一点小小经验,若有错误观念请指正~ 谢谢:) ※ 编辑: tinapig 来自: 123.110.26.146 (04/12 01:21)