※ 引述《abbyyam (ㄟ逼)》之銘言： : ※ 引述《abbyyam (ㄟ逼)》之銘言： : : 小弟最近做Western遇到的困擾是我的Target protein的band都糊糊的 : : 不夠shape，所以讓老闆非常的不滿 ^^^^^^^^^^ 哈~我最近也遇到這個問題,洗出來的和原po簡直一樣,昨天剛解決 @@ : : 但是在actin的部分就很OK ^^^^^^^^^^^^^^^^^^我比您糟一點,我連Actin都糊掉了 >"< : : 我的target protein的大小是50~55kDa左右 ^^^^^^^^^^ 我的是60kDa (P-Akt) : : 膠用過10%和12%的 : : Transfer是400mA 2.5hr (in ice bath) : : 所以到底是哪邊出了問題呢? : : 煩請幫忙　> < : http://www.wretch.cc/album/album.php?id=abbyyam&book=12 : 圖在此 : 另外我跑膠是用80V和100V在跑的 ^^^^^^^^^固定伏特跑膠我沒試過,我是固定安培 不過共通點應該都是不能跑太快 or 太慢 跑膠的時候如果發現marker已經開始糊了,就可以停止了 不夠sharp,我這邊做的修改有: 1.壓片時間縮短 (大約五分鐘左右就可以了) 2.電泳時間不要太短 or 太長 之前一開始趕時間就用40mA跑到底,只花了一個多小時, 不過出來的結果就是不夠sharp (要速度沒品質 ˊˋ) 後來用20mA跑約兩小時,過了stacking gel後改成40mA跑,效果不錯! 我老闆說他以前至少都跑三小時... \囧/ 3.12% gel改成 15% gel 這邊就比較注意一下,電泳的時候,15% gel會比較慢, 而且band 的間距會比較小,會花比較多時間跑 如果觀察到marker已經開始糊糊的,就該停止囉~ 4.transfer 我是用200mA 2hr (in 4度C 冰箱)就很夠用了 stir有轉動齁?!之前有一次沒注意到,結果出來的band...%&*#$ transfer的時候溫度太高也會讓band糊掉,嚴重的就什麼都沒了 >"< 400mA我覺得有點過高了,我最高只用過250mA 3hr 5.transfer buffer如果顏色有點藍藍的就重配吧 表示 marker 已經 "溶"(不知要怎麼形容) 進去了... transfer的效果就不好了 希望以上我的經驗能有幫助, 祝 原po實驗順利喔 ^^ 阿...這裡我想請問一個問題: 我的band顏色都很淺,沒辦法像原po黑的那麼漂亮 請問除了 顯影水 一抗 二抗 外,還有可能有哪些原因呢? 謝謝 --

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