※ 引述《abbyyam (ㄟ逼)》之铭言： : ※ 引述《abbyyam (ㄟ逼)》之铭言： : : 小弟最近做Western遇到的困扰是我的Target protein的band都糊糊的 : : 不够shape，所以让老板非常的不满 ^^^^^^^^^^ 哈~我最近也遇到这个问题,洗出来的和原po简直一样,昨天刚解决 @@ : : 但是在actin的部分就很OK ^^^^^^^^^^^^^^^^^^我比您糟一点,我连Actin都糊掉了 >"< : : 我的target protein的大小是50~55kDa左右 ^^^^^^^^^^ 我的是60kDa (P-Akt) : : 胶用过10%和12%的 : : Transfer是400mA 2.5hr (in ice bath) : : 所以到底是哪边出了问题呢? : : 烦请帮忙　> < : http://www.wretch.cc/album/album.php?id=abbyyam&book=12 : 图在此 : 另外我跑胶是用80V和100V在跑的 ^^^^^^^^^固定伏特跑胶我没试过,我是固定安培 不过共通点应该都是不能跑太快 or 太慢 跑胶的时候如果发现marker已经开始糊了,就可以停止了 不够sharp,我这边做的修改有: 1.压片时间缩短 (大约五分钟左右就可以了) 2.电泳时间不要太短 or 太长 之前一开始赶时间就用40mA跑到底,只花了一个多小时, 不过出来的结果就是不够sharp (要速度没品质 ˊˋ) 後来用20mA跑约两小时,过了stacking gel後改成40mA跑,效果不错! 我老板说他以前至少都跑三小时... \囧/ 3.12% gel改成 15% gel 这边就比较注意一下,电泳的时候,15% gel会比较慢, 而且band 的间距会比较小,会花比较多时间跑 如果观察到marker已经开始糊糊的,就该停止罗~ 4.transfer 我是用200mA 2hr (in 4度C 冰箱)就很够用了 stir有转动齁?!之前有一次没注意到,结果出来的band...%&*#$ transfer的时候温度太高也会让band糊掉,严重的就什麽都没了 >"< 400mA我觉得有点过高了,我最高只用过250mA 3hr 5.transfer buffer如果颜色有点蓝蓝的就重配吧 表示 marker 已经 "溶"(不知要怎麽形容) 进去了... transfer的效果就不好了 希望以上我的经验能有帮助, 祝 原po实验顺利喔 ^^ 阿...这里我想请问一个问题: 我的band颜色都很浅,没办法像原po黑的那麽漂亮 请问除了 显影水 一抗 二抗 外,还有可能有哪些原因呢? 谢谢 --

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