作者mywaygodgive (金蕉)
站內Biotech
標題[求救] southern的問題
時間Tue Apr 7 11:09:46 2009
請教版上各位前輩
我正在做southern 測定mouse的DNA片段
可是效果一直很差 很不穩定
有時酵素切不動 雜交也不完全
每次做的結果都不大相同 = =a
以下是實驗步驟和條件
切酵素:
total :200 ul
DNA:5 ug (大約7 ul)
酵素：分別是 EcoRI HindIII BanHI 分三管各2ul
bfr:20 ul
作用溫度：37度
時間：18~24小時
有時候切的動 有時切不動...
之後會用isopropanal 和70% 酒精 沉澱純化 回溶在15 ul的2D水
步驟:
1.加入3M NaoAc 10 ul及ice isopropanal 200 ul
2.置於-80度 20min
3.4度C 高速離心 15min後去除上清液
4.加入70%酒精 200 ul 輕輕搖晃30次左右
5.4度C高速離心 15min 去上清液
6. air-dry後溶於2D水
純化後都有跑膠測試，看起來都沒問題
之後就直接跑大片膠轉膜了(用的是Assembling the Transfer unit,用抽氣機)
雜交是用Roche的Kit
請問...這樣看的出有什麼問題嗎?
個人認為 酵素切不動是不是總體積太小?
還有...有什麼因素會影響到雜交呢?(除了溫度以外)
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.98.90
1F：推 sGoat:請問用幾U酵素去切? 04/07 11:19
2F：→ mywaygodgive:NEB的酵素 2 ul的量大約是40U 04/07 11:28
3F：→ Rarelay:純化之後跑膠都沒問題...那你怎麼會認為是切不動？ 04/07 11:30
4F：→ mywaygodgive:抱歉 語意不清<(_ _)> 每次切都會有幾管sample還可 04/07 11:34
5F：→ mywaygodgive:以看到band 然後因為實驗沒辦法停就繼續做...其他管 04/07 11:35
6F：→ mywaygodgive:的sample(有切動的)純化看似正常 04/07 11:35
7F：推 owl628:體積不會是問題,我total才15ul,也沒有失敗過,會不會是酵素 04/07 12:25
8F：→ owl628:加太多,因為我10ug的genomic DNA用10U的酵素切就很漂亮了 04/07 12:26
9F：推 Rarelay:有沒有切開雜交都要看的到東西。 04/07 13:56
10F：推 sGoat:以你這3管NEB酵素而言切gDNA應該都很輕鬆,請問如何取gDNA? 04/07 16:32
11F：→ sGoat:還有切完到跑膠轉膜應該有很多點可以停,不仿確定樣品OK再轉 04/07 16:34
12F：→ sGoat:切不切得完全會影響雜交效益,不如確定每一步再作下去... 04/07 16:36
13F：推 sGoat:還有個問題,切完不都會跑膠確定是否切完全?純化看似正常指? 04/07 16:49
14F：→ sGoat:然後一個建議,gDNA要加15ug以上去做比較好,太少會有lost問題 04/07 16:51
15F：→ mywaygodgive:加上未加酵素的共有8個sample,有的很明顯還有band 04/07 17:44
16F：→ mywaygodgive:純化後跑的gel就像一般酵素切完的樣子(沒切動的也還 04/07 17:45
17F：→ mywaygodgive:是那樣有band出現 DNA是用promega的kit抽的 04/07 17:47
18F：推 sGoat:如果你意思是有切跟沒切純化後跑膠pattern一樣,但是southern 04/08 10:27
19F：→ sGoat:結果出來不一樣 1.使用southern probe相同但是結果不同=技術 04/08 10:29
20F：→ sGoat:問題 2.使用不同probe=>這沒啥好講,就是不同 3.組織不同但 04/08 10:31
21F：→ sGoat:是probe相同=>可能是methylation的影響 04/08 10:32