作者mywaygodgive (金蕉)
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标题[求救] southern的问题
时间Tue Apr 7 11:09:46 2009
请教版上各位前辈
我正在做southern 测定mouse的DNA片段
可是效果一直很差 很不稳定
有时酵素切不动 杂交也不完全
每次做的结果都不大相同 = =a
以下是实验步骤和条件
切酵素:
total :200 ul
DNA:5 ug (大约7 ul)
酵素：分别是 EcoRI HindIII BanHI 分三管各2ul
bfr:20 ul
作用温度：37度
时间：18~24小时
有时候切的动 有时切不动...
之後会用isopropanal 和70% 酒精 沉淀纯化 回溶在15 ul的2D水
步骤:
1.加入3M NaoAc 10 ul及ice isopropanal 200 ul
2.置於-80度 20min
3.4度C 高速离心 15min後去除上清液
4.加入70%酒精 200 ul 轻轻摇晃30次左右
5.4度C高速离心 15min 去上清液
6. air-dry後溶於2D水
纯化後都有跑胶测试，看起来都没问题
之後就直接跑大片胶转膜了(用的是Assembling the Transfer unit,用抽气机)
杂交是用Roche的Kit
请问...这样看的出有什麽问题吗?
个人认为 酵素切不动是不是总体积太小?
还有...有什麽因素会影响到杂交呢?(除了温度以外)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.98.90
1F：推 sGoat:请问用几U酵素去切? 04/07 11:19
2F：→ mywaygodgive:NEB的酵素 2 ul的量大约是40U 04/07 11:28
3F：→ Rarelay:纯化之後跑胶都没问题...那你怎麽会认为是切不动？ 04/07 11:30
4F：→ mywaygodgive:抱歉 语意不清<(_ _)> 每次切都会有几管sample还可 04/07 11:34
5F：→ mywaygodgive:以看到band 然後因为实验没办法停就继续做...其他管 04/07 11:35
6F：→ mywaygodgive:的sample(有切动的)纯化看似正常 04/07 11:35
7F：推 owl628:体积不会是问题,我total才15ul,也没有失败过,会不会是酵素 04/07 12:25
8F：→ owl628:加太多,因为我10ug的genomic DNA用10U的酵素切就很漂亮了 04/07 12:26
9F：推 Rarelay:有没有切开杂交都要看的到东西。 04/07 13:56
10F：推 sGoat:以你这3管NEB酵素而言切gDNA应该都很轻松,请问如何取gDNA? 04/07 16:32
11F：→ sGoat:还有切完到跑胶转膜应该有很多点可以停,不仿确定样品OK再转 04/07 16:34
12F：→ sGoat:切不切得完全会影响杂交效益,不如确定每一步再作下去... 04/07 16:36
13F：推 sGoat:还有个问题,切完不都会跑胶确定是否切完全?纯化看似正常指? 04/07 16:49
14F：→ sGoat:然後一个建议,gDNA要加15ug以上去做比较好,太少会有lost问题 04/07 16:51
15F：→ mywaygodgive:加上未加酵素的共有8个sample,有的很明显还有band 04/07 17:44
16F：→ mywaygodgive:纯化後跑的gel就像一般酵素切完的样子(没切动的也还 04/07 17:45
17F：→ mywaygodgive:是那样有band出现 DNA是用promega的kit抽的 04/07 17:47
18F：推 sGoat:如果你意思是有切跟没切纯化後跑胶pattern一样,但是southern 04/08 10:27
19F：→ sGoat:结果出来不一样 1.使用southern probe相同但是结果不同=技术 04/08 10:29
20F：→ sGoat:问题 2.使用不同probe=>这没啥好讲,就是不同 3.组织不同但 04/08 10:31
21F：→ sGoat:是probe相同=>可能是methylation的影响 04/08 10:32