作者tingyi ( 新目標 新方向)
看板Biotech
標題[求救] transform後長不出菌?
時間Sat Apr 4 17:27:21 2009
我在做full-length的ZO-1 cloning
我將P出的ZO-1先接進TA clone中做藍白篩選
挑出了兩個OK的colonies
用KpnI and SpeI切下我的insert
大小約5.7Kb
再接進我的expression plasmid裡
我的plasmid是切KpnI and XbaI
(補充一點:因為ZO-1太多RE site都是我plasmid上有的
所以我只好找切位可以互補的兩種RE)
現在問題出現在
我的insert 和vector ligate 16度C 16hrs後
transform 到 DH5alpha 裡都長不出菌來
已經試過兩次了
不知道到裡哪邊出了問題?
麻煩幫我解惑一下
感恩呀~~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.229.71.118
1F：推 kaifish:可能的原因太多了...每個步驟是否都有做positive control? 04/04 17:56
2F：→ tingyi:要用甚麼東西當positive control呀? 04/04 21:15
3F：→ dankai:我覺得你可以另外找個人重做一次~說不定手法問題!! 04/04 21:25
4F：推 ranilla:vector的兩酵素分兩次切看看，不行的話，換我做，三天給你 04/04 23:06
5F：推 SkyChaos:我也想要樓上幫我做 XD 不過這就是Ligation (嘆) 04/05 04:43
6F：推 hurdle:你的plasmid裡的XbaI site是gaTCTAGA or TCTAGAtc嗎?? 04/05 10:59
7F：→ hurdle:如果是, 那你當初在purify你的vector時應該要用 04/05 11:01
8F：→ hurdle:dam deficient的strain, 因為dam methylase會block你的XbaI 04/05 11:02
9F：→ hurdle:所以, 基本上你的vector只有single cut... 04/05 11:02
10F：→ hurdle:PS: dam deficient strain: GM2163....etc. 04/05 11:04
11F：推 honny7410:不過,若如樓上所說,應該會長出很多self-ligation的clone 04/05 15:24
12F：→ honny7410:都沒長的話,也許是ligation或transform有問題 04/05 15:26
13F：→ honny7410:如果你是用二倍ligation buffer的話,試著"稍微"聞一下 04/05 15:28
14F：→ honny7410:如果沒有臭味的話,就代表它失效了,或者乾脆跟別人借 04/05 15:30
15F：→ honny7410:ligation的東西來用,transform時也要做transform 04/05 15:32
16F：→ honny7410:efficiency control 04/05 15:32
17F：推 hurdle:ㄟ~~原PO應該有用alkaline phosphatase處理vector吧~~?? 04/06 01:44
18F：→ tingyi:感謝大家 經搖過LB後 目前已經長出colony了 好開心喔XD 04/10 11:27