作者tingyi ( 新目标 新方向)
看板Biotech
标题[求救] transform後长不出菌?
时间Sat Apr 4 17:27:21 2009
我在做full-length的ZO-1 cloning
我将P出的ZO-1先接进TA clone中做蓝白筛选
挑出了两个OK的colonies
用KpnI and SpeI切下我的insert
大小约5.7Kb
再接进我的expression plasmid里
我的plasmid是切KpnI and XbaI
(补充一点:因为ZO-1太多RE site都是我plasmid上有的
所以我只好找切位可以互补的两种RE)
现在问题出现在
我的insert 和vector ligate 16度C 16hrs後
transform 到 DH5alpha 里都长不出菌来
已经试过两次了
不知道到里哪边出了问题?
麻烦帮我解惑一下
感恩呀~~
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◆ From: 61.229.71.118
1F：推 kaifish:可能的原因太多了...每个步骤是否都有做positive control? 04/04 17:56
2F：→ tingyi:要用甚麽东西当positive control呀? 04/04 21:15
3F：→ dankai:我觉得你可以另外找个人重做一次~说不定手法问题!! 04/04 21:25
4F：推 ranilla:vector的两酵素分两次切看看，不行的话，换我做，三天给你 04/04 23:06
5F：推 SkyChaos:我也想要楼上帮我做 XD 不过这就是Ligation (叹) 04/05 04:43
6F：推 hurdle:你的plasmid里的XbaI site是gaTCTAGA or TCTAGAtc吗?? 04/05 10:59
7F：→ hurdle:如果是, 那你当初在purify你的vector时应该要用 04/05 11:01
8F：→ hurdle:dam deficient的strain, 因为dam methylase会block你的XbaI 04/05 11:02
9F：→ hurdle:所以, 基本上你的vector只有single cut... 04/05 11:02
10F：→ hurdle:PS: dam deficient strain: GM2163....etc. 04/05 11:04
11F：推 honny7410:不过,若如楼上所说,应该会长出很多self-ligation的clone 04/05 15:24
12F：→ honny7410:都没长的话,也许是ligation或transform有问题 04/05 15:26
13F：→ honny7410:如果你是用二倍ligation buffer的话,试着"稍微"闻一下 04/05 15:28
14F：→ honny7410:如果没有臭味的话,就代表它失效了,或者乾脆跟别人借 04/05 15:30
15F：→ honny7410:ligation的东西来用,transform时也要做transform 04/05 15:32
16F：→ honny7410:efficiency control 04/05 15:32
17F：推 hurdle:ㄟ~~原PO应该有用alkaline phosphatase处理vector吧~~?? 04/06 01:44
18F：→ tingyi:感谢大家 经摇过LB後 目前已经长出colony了 好开心喔XD 04/10 11:27