1.先在data base上找到目標基因的genomic gene 序列 及 目標基因的mRNA 序列 2.將兩序列儲存至同一個文字文件 ( .txt檔 ) 3.利用Bioedit軟體將兩序列開啟 4.執行軟體上方sequence選項內的Pairwise alignment裡的 Align two sequences(optimal GLOBAL alignment) 選項 5.待軟體計算完，即可得到 genomic gene序列 + 已經對齊好的 mRNA序列 Ex: genomic ACGTATTGTCAACTGAGCGATCTCCGTAAAGTTAGTTCGATCACACGTCAGCTACGATCTCGTA mRNA ACGTATTGTCAACTGAGCGATCTC------------------------------CGATCTCGTA ^^^^^^^^^^^^ ^^^^^^^^ (12 mer) (8 mer) AT: 8 mer CG: 12 mer CG% = 60 % primer序列:CTGAGCGATCTCCGATCTCG 6.primer設計技巧 設計此primer是為了要避免掉genomic DNA的干擾 Taq在合成PCR產物時靠的是primer 3'端是否有黏接完全， 換句話說~3'端若是沒有黏接DNA template即無法合成出產物 因此 在設計primer時，可採用5'端序列長度較長(約10~14個mer) 3'端序列較短(約8~10個mer)，而本人習慣設計高GC比(約55~65%間) 因這樣annealing溫度可以提高，增加primer專一性，且可以排除那 些3'端黏合在模板上的機率。另外，需注意primer設計時序列會不會 自行黏合，也盡量避免設計到迴文序列，基本上這樣的primer專一性 都會很高。 另外補充 1.AT在計算Tm值時 皆算2度 CG 4度 所得的溫度減5度，即可當做抓最適條件時annealing的溫度 2.設計Antisense時，請記得將該序列反轉並倒寫 正常序列 Ex.CTGAGCGATCTCCGATCTCG 反轉+倒寫 CGAGATCGGAGATCGCTCAG ------------------------------------------------------------------------ 因本身是非生技本科系學生，一路走來真的很辛苦，也碰到很多挫折 因此，提供一些基本知識來讓像我一樣背景的同學能夠讓實驗快速上手 祝大家早日脫離苦海吧!! 特別聲明 本方法可允許轉載編輯，但請註明來源作者 -- ※ 編輯: andy731 來自: 192.83.195.230 (04/03 02:09)