1.先在data base上找到目标基因的genomic gene 序列 及 目标基因的mRNA 序列 2.将两序列储存至同一个文字文件 ( .txt档 ) 3.利用Bioedit软体将两序列开启 4.执行软体上方sequence选项内的Pairwise alignment里的 Align two sequences(optimal GLOBAL alignment) 选项 5.待软体计算完，即可得到 genomic gene序列 + 已经对齐好的 mRNA序列 Ex: genomic ACGTATTGTCAACTGAGCGATCTCCGTAAAGTTAGTTCGATCACACGTCAGCTACGATCTCGTA mRNA ACGTATTGTCAACTGAGCGATCTC------------------------------CGATCTCGTA ^^^^^^^^^^^^ ^^^^^^^^ (12 mer) (8 mer) AT: 8 mer CG: 12 mer CG% = 60 % primer序列:CTGAGCGATCTCCGATCTCG 6.primer设计技巧 设计此primer是为了要避免掉genomic DNA的干扰 Taq在合成PCR产物时靠的是primer 3'端是否有黏接完全， 换句话说~3'端若是没有黏接DNA template即无法合成出产物 因此 在设计primer时，可采用5'端序列长度较长(约10~14个mer) 3'端序列较短(约8~10个mer)，而本人习惯设计高GC比(约55~65%间) 因这样annealing温度可以提高，增加primer专一性，且可以排除那 些3'端黏合在模板上的机率。另外，需注意primer设计时序列会不会 自行黏合，也尽量避免设计到回文序列，基本上这样的primer专一性 都会很高。 另外补充 1.AT在计算Tm值时 皆算2度 CG 4度 所得的温度减5度，即可当做抓最适条件时annealing的温度 2.设计Antisense时，请记得将该序列反转并倒写 正常序列 Ex.CTGAGCGATCTCCGATCTCG 反转+倒写 CGAGATCGGAGATCGCTCAG ------------------------------------------------------------------------ 因本身是非生技本科系学生，一路走来真的很辛苦，也碰到很多挫折 因此，提供一些基本知识来让像我一样背景的同学能够让实验快速上手 祝大家早日脱离苦海吧!! 特别声明 本方法可允许转载编辑，但请注明来源作者 -- ※ 编辑: andy731 来自: 192.83.195.230 (04/03 02:09)