看板Biotech
標 題Re: [求救] TA cloning問題
發信站LIFE (Wed Mar 4 16:37:05 2009)
轉信站ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!LIFE
我這邊也遇過同樣的問題，但是原因為何還不清楚。
但是調整pcr條件會是首要的，因為膠體回收之後的產物拿去做ta clone常常會出錯，
建議盡可能調整pcr條件，讓產物專一些，或是讓產物的band比其他雜帶亮一些，然後
直接拿去做ta clone， 你篩到目標產物的機率會大一些。
※ 引述《[email protected] (嗨大家好)》之銘言：
> 各位好，
> 我目前正在進行環境中微生物某特定基因diversity之調查，
> gene經過PCR後的products約為430bp，PCR最後一個step為72度C 10min
> 由跑膠的結果看來目標產物是足夠的，但是primer dimer也滿嚴重的
> PCR的ingredient中含有50 pmole的primer (each)和200 micromolar的dNTP
> (marker 100bp以下有亮帶)
> 接下來的TA cloning做過很多次，有將PCR product用gel purification過的，
> 但也有沒有經過純化過的。
> 我使用的是Invitrogen的TA cloning kit
> competent cells 為 OneShot(R) TOP10
> ligation rxn mixture中含有 1uL的 PCR products (total為6uL)
> 配好ligation rxn mixture後的incubate time為30min (at 22oC)
> 將ligation rxn mixture取2uL加到50uL的 competent cell後放置冰上30min
> heat shock 30sec後 放回冰上 大概三分鐘後就加入SOC medium然後在培養1 hr
> 可是結果卻是只長了幾顆藍色的，白色的大概只有一兩顆，size也不對
> 請問各位先進，不知有什麼建議可以改善這個問題？
> 該Kit使用其他PCR product進行cloning都沒問題，唯獨這個有問題
> 感謝各位 Orz
--
┌┼ Or
igin:
國立中興大學˙中興生科 bbs.life.nchu.edu.tw
└┘ A
uthor:
kissme 從 140.120.209.238 發表