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标 题Re: [求救] TA cloning问题
发信站LIFE (Wed Mar 4 16:37:05 2009)
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我这边也遇过同样的问题，但是原因为何还不清楚。
但是调整pcr条件会是首要的，因为胶体回收之後的产物拿去做ta clone常常会出错，
建议尽可能调整pcr条件，让产物专一些，或是让产物的band比其他杂带亮一些，然後
直接拿去做ta clone， 你筛到目标产物的机率会大一些。
※ 引述《[email protected] (嗨大家好)》之铭言：
> 各位好，
> 我目前正在进行环境中微生物某特定基因diversity之调查，
> gene经过PCR後的products约为430bp，PCR最後一个step为72度C 10min
> 由跑胶的结果看来目标产物是足够的，但是primer dimer也满严重的
> PCR的ingredient中含有50 pmole的primer (each)和200 micromolar的dNTP
> (marker 100bp以下有亮带)
> 接下来的TA cloning做过很多次，有将PCR product用gel purification过的，
> 但也有没有经过纯化过的。
> 我使用的是Invitrogen的TA cloning kit
> competent cells 为 OneShot(R) TOP10
> ligation rxn mixture中含有 1uL的 PCR products (total为6uL)
> 配好ligation rxn mixture後的incubate time为30min (at 22oC)
> 将ligation rxn mixture取2uL加到50uL的 competent cell後放置冰上30min
> heat shock 30sec後 放回冰上 大概三分钟後就加入SOC medium然後在培养1 hr
> 可是结果却是只长了几颗蓝色的，白色的大概只有一两颗，size也不对
> 请问各位先进，不知有什麽建议可以改善这个问题？
> 该Kit使用其他PCR product进行cloning都没问题，唯独这个有问题
> 感谢各位 Orz
--
┌┼ Or
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国立中兴大学˙中兴生科 bbs.life.nchu.edu.tw
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kissme 从 140.120.209.238 发表