作者conie0831 (cc)
看板Biotech
標題[討論] 關於ligation問題?
時間Tue Mar 3 22:04:59 2009
在做ligation時,insert至少要多少總量,才比較容易成功(都依照insert:vector=3:1).
因為我的insert濃度很低,約5ng/ul,我不知道我的insert濃度是否會太低?
另外insert經過限制?切割後,一般會在進行膠體純化,像我的insert濃度這麼低,如果經過
這個步驟,insert一定又會損失(怕insert全部回收不回來),所以這個步驟是否可省略,
直接將restriction enzyme solution進行ligation,是否可行?
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.135.98.104
1F：推 tsubasawolfy:Insert切多一點不就好了Orz 03/03 22:06
2F：推 aceliang:你enzyme digestion的buffer system不適用於T4 ligase吧 03/03 22:11
3F：推 tsubasawolfy:拿RE完的直接ligation..那你原insert的vector不就再 03/03 22:12
4F：→ tsubasawolfy:黏回去... 03/03 22:12
5F：→ aceliang:這樣整個ligation環境不都一些亂入的buffer... 03/03 22:12
6F：推 sGoat:如果切位可以接的上去的話就可以,多挑一些一定挑得出來 03/03 22:40
7F：→ sGoat:buffer跟原先vector的干擾都不會有問題,挑對大小的plasmid 03/03 22:42
8F：→ sGoat:就OK... 03/03 22:42
9F：→ sGoat:另外insert濃度太低,以commercial vector養菌放大再剪切回收 03/03 22:44
10F：→ sGoat:就可以放大濃度... 03/03 22:45
11F：→ conie0831:我的insert是一段cDNA,尚未接入cloning vector中 03/03 23:04
12F：→ conie0831:所以無法利用養菌放大方式來放大濃度 03/03 23:06
13F：推 tsubasawolfy:PCR呢? 多P幾管再一起clean up或酒精沉澱 03/03 23:13
14F：推 sGoat:cDNA若不是單股,一定可以T/A cloning,即使是RACE或是RT出來 03/04 00:26
15F：→ sGoat:的經過養菌放大的質量都比P多管PCR產物回收來的好 03/04 00:27
16F：→ sGoat:與其一開始搞個難題去衍生後續實驗的麻煩,不妨考慮一下 03/04 00:28
17F：→ sGoat:一開始在前期得到大量精確的DNA順順的作下去,參考一下^^ 03/04 00:31
18F：推 sGoat:當然如果PCR就可以得到大量產物的話PCR就好,原po的問題 03/04 00:50
19F：→ sGoat:若是PCR出來的band或是經由非PCR方式得到cDNA的話,建議養菌 03/04 00:51
20F：→ sGoat: ^band很少^ 03/04 00:52