作者conie0831 (cc)
看板Biotech
标题[讨论] 关於ligation问题?
时间Tue Mar 3 22:04:59 2009
在做ligation时,insert至少要多少总量,才比较容易成功(都依照insert:vector=3:1).
因为我的insert浓度很低,约5ng/ul,我不知道我的insert浓度是否会太低?
另外insert经过限制?切割後,一般会在进行胶体纯化,像我的insert浓度这麽低,如果经过
这个步骤,insert一定又会损失(怕insert全部回收不回来),所以这个步骤是否可省略,
直接将restriction enzyme solution进行ligation,是否可行?
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◆ From: 220.135.98.104
1F：推 tsubasawolfy:Insert切多一点不就好了Orz 03/03 22:06
2F：推 aceliang:你enzyme digestion的buffer system不适用於T4 ligase吧 03/03 22:11
3F：推 tsubasawolfy:拿RE完的直接ligation..那你原insert的vector不就再 03/03 22:12
4F：→ tsubasawolfy:黏回去... 03/03 22:12
5F：→ aceliang:这样整个ligation环境不都一些乱入的buffer... 03/03 22:12
6F：推 sGoat:如果切位可以接的上去的话就可以,多挑一些一定挑得出来 03/03 22:40
7F：→ sGoat:buffer跟原先vector的干扰都不会有问题,挑对大小的plasmid 03/03 22:42
8F：→ sGoat:就OK... 03/03 22:42
9F：→ sGoat:另外insert浓度太低,以commercial vector养菌放大再剪切回收 03/03 22:44
10F：→ sGoat:就可以放大浓度... 03/03 22:45
11F：→ conie0831:我的insert是一段cDNA,尚未接入cloning vector中 03/03 23:04
12F：→ conie0831:所以无法利用养菌放大方式来放大浓度 03/03 23:06
13F：推 tsubasawolfy:PCR呢? 多P几管再一起clean up或酒精沉淀 03/03 23:13
14F：推 sGoat:cDNA若不是单股,一定可以T/A cloning,即使是RACE或是RT出来 03/04 00:26
15F：→ sGoat:的经过养菌放大的质量都比P多管PCR产物回收来的好 03/04 00:27
16F：→ sGoat:与其一开始搞个难题去衍生後续实验的麻烦,不妨考虑一下 03/04 00:28
17F：→ sGoat:一开始在前期得到大量精确的DNA顺顺的作下去,参考一下^^ 03/04 00:31
18F：推 sGoat:当然如果PCR就可以得到大量产物的话PCR就好,原po的问题 03/04 00:50
19F：→ sGoat:若是PCR出来的band或是经由非PCR方式得到cDNA的话,建议养菌 03/04 00:51
20F：→ sGoat: ^band很少^ 03/04 00:52