作者bbiioo (梅子)
看板Biotech
標題[求救] pET29純化
時間Tue Mar 3 16:35:59 2009
目前已把目標基因(1.5kb)接到pET29載體上
也已經表現出來 形成 inclusing body
目前想說先把蛋白純化出來 打小白鼠作抗體
蛋白有確定有表現
但就是純化不出來 我用的是 talon resin 進行純化
基因架接的方式..有點難敘述 用圖檔呈現囉
http://photo.xuite.net/bio.f21/3108685
我都有把我目標基因的stop codon給去掉
不知道這樣的設計有哪邊可能出問題?
麻煩大家幫幫忙了
謝謝
我純化方式：
菌液離心取沉澱物 以tris回溶 破菌
之後再離心 沉澱物用含有guanidine hydrochloride的buffer回溶，
(6M guanidine hydrochloride 20mM Tris 0.5MaCl 5mMimidazole 1mM B-me)
之後就作管柱純化!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.38.65
1F：推 runpapa0520:你inclusing body有先用urea溶掉嗎? 03/03 17:51
2F：→ bbiioo:我用guanudine-HCl先溶 03/03 21:40
※ 編輯: bbiioo 來自: 140.130.38.65 (03/03 21:47)
※ 編輯: bbiioo 來自: 140.130.38.65 (03/03 21:48)
3F：推 sGoat:1.先檢查His-Tag有沒有in frame 2.直接黏在蛋白後表現的His 03/04 00:42
4F：→ sGoat:Tag有時候因為跟前面的蛋白太近會干擾其純化效率 03/04 00:43
5F：→ sGoat:3.Tag若包在inclusion body內=無解,請拿soluble form試試 03/04 00:45
6F：→ bbiioo:恩..1.應該是有in frame 3.有用guanidine-HCl先溶 03/04 09:25
7F：推 chiehgriffin:用10oC表現你的蛋白質試看看 03/04 23:08
8F：推 Fourfish:恩?回溶的buffer有imidazole?去掉試試看 可能你的protein 03/07 15:45
9F：→ Fourfish:binding太弱 03/07 15:46
10F：推 Fourfish:喔對！管柱純化過程的buffer都有含guanudine-HCL嗎？ 03/07 15:50
12F：→ sneak: //muxiv.com 01/03 16:52