作者bbiioo (梅子)
看板Biotech
标题[求救] pET29纯化
时间Tue Mar 3 16:35:59 2009
目前已把目标基因(1.5kb)接到pET29载体上
也已经表现出来 形成 inclusing body
目前想说先把蛋白纯化出来 打小白鼠作抗体
蛋白有确定有表现
但就是纯化不出来 我用的是 talon resin 进行纯化
基因架接的方式..有点难叙述 用图档呈现罗
http://photo.xuite.net/bio.f21/3108685
我都有把我目标基因的stop codon给去掉
不知道这样的设计有哪边可能出问题?
麻烦大家帮帮忙了
谢谢
我纯化方式：
菌液离心取沉淀物 以tris回溶 破菌
之後再离心 沉淀物用含有guanidine hydrochloride的buffer回溶，
(6M guanidine hydrochloride 20mM Tris 0.5MaCl 5mMimidazole 1mM B-me)
之後就作管柱纯化!
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.38.65
1F：推 runpapa0520:你inclusing body有先用urea溶掉吗? 03/03 17:51
2F：→ bbiioo:我用guanudine-HCl先溶 03/03 21:40
※ 编辑: bbiioo 来自: 140.130.38.65 (03/03 21:47)
※ 编辑: bbiioo 来自: 140.130.38.65 (03/03 21:48)
3F：推 sGoat:1.先检查His-Tag有没有in frame 2.直接黏在蛋白後表现的His 03/04 00:42
4F：→ sGoat:Tag有时候因为跟前面的蛋白太近会干扰其纯化效率 03/04 00:43
5F：→ sGoat:3.Tag若包在inclusion body内=无解,请拿soluble form试试 03/04 00:45
6F：→ bbiioo:恩..1.应该是有in frame 3.有用guanidine-HCl先溶 03/04 09:25
7F：推 chiehgriffin:用10oC表现你的蛋白质试看看 03/04 23:08
8F：推 Fourfish:恩?回溶的buffer有imidazole?去掉试试看 可能你的protein 03/07 15:45
9F：→ Fourfish:binding太弱 03/07 15:46
10F：推 Fourfish:喔对！管柱纯化过程的buffer都有含guanudine-HCL吗？ 03/07 15:50
12F：→ sneak: //muxiv.com 01/03 16:52