作者smallcoldair (嗨大家好)
看板Biotech
標題[求救] TA cloning問題
時間Sun Mar 1 22:04:06 2009
各位好，
我目前正在進行環境中微生物某特定基因diversity之調查，
gene經過PCR後的products約為430bp，PCR最後一個step為72度C 10min
由跑膠的結果看來目標產物是足夠的，但是primer dimer也滿嚴重的
PCR的ingredient中含有50 pmole的primer (each)和200 micromolar的dNTP
(marker 100bp以下有亮帶)
接下來的TA cloning做過很多次，有將PCR product用gel purification過的，
但也有沒有經過純化過的。
我使用的是Invitrogen的TA cloning kit
competent cells 為 OneShot(R) TOP10
ligation rxn mixture中含有 1uL的 PCR products (total為6uL)
配好ligation rxn mixture後的incubate time為30min (at 22oC)
將ligation rxn mixture取2uL加到50uL的 competent cell後放置冰上30min
heat shock 30sec後 放回冰上 大概三分鐘後就加入SOC medium然後在培養1 hr
可是結果卻是只長了幾顆藍色的，白色的大概只有一兩顆，size也不對
請問各位先進，不知有什麼建議可以改善這個問題？
該Kit使用其他PCR product進行cloning都沒問題，唯獨這個有問題
感謝各位 Orz
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.34.161
1F：推 hchs890843:有沒有試過拿藍色的出來pcr看看...有時候會中獎 03/01 22:35
2F：推 alaric:你確定PCR product 有a-tail? 03/01 23:53
3F：推 NKTcell:6ul可以全加... 然後就是PCR不要用pfu的 03/02 00:12
4F：→ smallcoldair:我是用PrimeTaq 03/02 01:11
5F：推 damyr:ligation時間太短了吧，我們都是室溫2小時 or 4度C o/n 03/02 03:01
6F：推 damyr:colony數目也太少了，你都培養一小時了 03/02 03:03
7F：→ damyr:一種就是你ligation mixture還沒反應完全(或加太少) 03/02 03:04
8F：→ damyr:另一種可能就是你的competent cell pfu太好，把你transform 03/02 03:06
9F：→ damyr:進去的白菌競爭掉了 03/02 03:06
10F：推 damyr:TA cloning的菌可以直接塗，不用再培養了 03/02 03:08
11F：推 wangharry:pcr primer to 25%,ligation to 1hr, heat shock try 03/02 09:27
12F：→ wangharry:43 degree C, 90sec 03/02 09:28
13F：→ wangharry:heat shock我曾經放到忘掉，過了五分鐘，還是挑的到 03/02 09:29
14F：→ smallcoldair:請問各位 PCR product可用spin column purify嗎? 03/02 14:48
15F：推 bluecsky:size不對但是是白色的你有挑來看看嗎? 03/03 14:40
16F：→ bluecsky:我覺得是你ligation時間太短了 可以再長一點 03/03 14:40
17F：推 leoblack:有考慮12℃ o/n ligation嘛?! 03/03 20:49
18F：推 TOTO:這個kit標榜5min in RT就可以完成接合，最多可增長至30min 03/03 22:33
19F：→ TOTO:之前我做一般小段DNA也沒問題，現在做一段GC rich的就還在試 03/03 22:34
20F：推 bluecsky:不過我之前做 一樣用這套TA kit...是真的效率超高的 03/03 23:01
21F：→ bluecsky:或許再試試吧 雖然我之前做是完全照說明書做沒問題 03/03 23:03
22F：推 blence:以往一直有這種現象,但這次最明顯,bbs可以討論很多問題,但 03/03 23:55
23F：→ blence:不見得每個說法都是正確的,尤其牽涉到說明書很多人不曾翻閱 03/03 23:56
24F：推 sGoat:藍白colony不成比例,可參考一下trouble shooting中的方法 03/04 01:02