作者smallcoldair (嗨大家好)
看板Biotech
标题[求救] TA cloning问题
时间Sun Mar 1 22:04:06 2009
各位好，
我目前正在进行环境中微生物某特定基因diversity之调查，
gene经过PCR後的products约为430bp，PCR最後一个step为72度C 10min
由跑胶的结果看来目标产物是足够的，但是primer dimer也满严重的
PCR的ingredient中含有50 pmole的primer (each)和200 micromolar的dNTP
(marker 100bp以下有亮带)
接下来的TA cloning做过很多次，有将PCR product用gel purification过的，
但也有没有经过纯化过的。
我使用的是Invitrogen的TA cloning kit
competent cells 为 OneShot(R) TOP10
ligation rxn mixture中含有 1uL的 PCR products (total为6uL)
配好ligation rxn mixture後的incubate time为30min (at 22oC)
将ligation rxn mixture取2uL加到50uL的 competent cell後放置冰上30min
heat shock 30sec後 放回冰上 大概三分钟後就加入SOC medium然後在培养1 hr
可是结果却是只长了几颗蓝色的，白色的大概只有一两颗，size也不对
请问各位先进，不知有什麽建议可以改善这个问题？
该Kit使用其他PCR product进行cloning都没问题，唯独这个有问题
感谢各位 Orz
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.34.161
1F：推 hchs890843:有没有试过拿蓝色的出来pcr看看...有时候会中奖 03/01 22:35
2F：推 alaric:你确定PCR product 有a-tail? 03/01 23:53
3F：推 NKTcell:6ul可以全加... 然後就是PCR不要用pfu的 03/02 00:12
4F：→ smallcoldair:我是用PrimeTaq 03/02 01:11
5F：推 damyr:ligation时间太短了吧，我们都是室温2小时 or 4度C o/n 03/02 03:01
6F：推 damyr:colony数目也太少了，你都培养一小时了 03/02 03:03
7F：→ damyr:一种就是你ligation mixture还没反应完全(或加太少) 03/02 03:04
8F：→ damyr:另一种可能就是你的competent cell pfu太好，把你transform 03/02 03:06
9F：→ damyr:进去的白菌竞争掉了 03/02 03:06
10F：推 damyr:TA cloning的菌可以直接涂，不用再培养了 03/02 03:08
11F：推 wangharry:pcr primer to 25%,ligation to 1hr, heat shock try 03/02 09:27
12F：→ wangharry:43 degree C, 90sec 03/02 09:28
13F：→ wangharry:heat shock我曾经放到忘掉，过了五分钟，还是挑的到 03/02 09:29
14F：→ smallcoldair:请问各位 PCR product可用spin column purify吗? 03/02 14:48
15F：推 bluecsky:size不对但是是白色的你有挑来看看吗? 03/03 14:40
16F：→ bluecsky:我觉得是你ligation时间太短了 可以再长一点 03/03 14:40
17F：推 leoblack:有考虑12℃ o/n ligation嘛?! 03/03 20:49
18F：推 TOTO:这个kit标榜5min in RT就可以完成接合，最多可增长至30min 03/03 22:33
19F：→ TOTO:之前我做一般小段DNA也没问题，现在做一段GC rich的就还在试 03/03 22:34
20F：推 bluecsky:不过我之前做 一样用这套TA kit...是真的效率超高的 03/03 23:01
21F：→ bluecsky:或许再试试吧 虽然我之前做是完全照说明书做没问题 03/03 23:03
22F：推 blence:以往一直有这种现象,但这次最明显,bbs可以讨论很多问题,但 03/03 23:55
23F：→ blence:不见得每个说法都是正确的,尤其牵涉到说明书很多人不曾翻阅 03/03 23:56
24F：推 sGoat:蓝白colony不成比例,可参考一下trouble shooting中的方法 03/04 01:02