作者cocoon121 (湛藍)
看板Biotech
標題[求救] Western bolt有下雨痕
時間Wed Feb 18 14:20:55 2009
大家好 我目前在做WB 所以以下有幾個問題想請教大家
首先我先付上我跑的條件
transfer 250 mA 55 min
blocking 室溫 1hr 以上 (5%牛奶 in 1X TBST)
wash 3 次 每次15分鐘以上
一抗 (1:500) O/N
wash 3 次 每次15分鐘以上
二抗 (1:2000) 1hr
wash 3 次 每次15分鐘以上
ECL呈色
我先付上我單跑SDS-PAGE的圖
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=azureblue&b=12&f=1051429584&p=3
整個PAGE也只有我要的BAND 分子量也對
可是 TRAN後我根據以上的條件去做
圖變成這樣><
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=azureblue&b=12&f=1051423799&p=0
有BAND沒錯 可是有下雨痕....
老師是說我WASH沒做好 可我後面再做 還是都有耶@@
做了好幾次都這樣.....有嚐試過抗體濃度改變 可有還是有 囧
我和學姊討論是想說會不會是一抗本來就是這樣
因為我的一抗是客製化抗體.....所以他來的時候是兔子血清
本來是想說 血清裡面很雜 是不是有其他雜七雜八的蛋白質在裡面
然後我就打電話去問產專
產專說 她覺得是我的blocking buffer 出問題
可是 我們家 blocking buffer 現配 自己要用的自己配
1X TBST 也是新鮮的 平均 一天半用掉1L(公用 BUFFER)
重點是 我們實驗室其他人跑都沒這個問題 = =|||
我現在跑的是plant protein
我之前有拿別人的sample跑 OK (別人的sample是 cell line)
我以前跑其他植物蛋白的WB也沒這個問題@@
所以技術上應該是OK
所以想請教看看 有人知道這個直線條的下雨痕是怎麼一回事嗎???
是5%不對?還是我要用PBST?????
可 PBST和TBST有什麼樣的差別呢???
ps 有嚐試過室溫下兩小時 可也是有下雨痕跡><
還有一個問題ㄚ 有一次我忘記把PVDF膜裁切
然後 去呈色 發現他在高分子量的部份也有BAND耶
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=azureblue&b=12&f=1051423801&p=2
可是 SDS-PAGE出來是沒有的阿 = =|||||
請問有人知道是為什麼嗎????
謝謝
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※ 編輯: cocoon121 來自: 140.130.97.175 (02/18 14:35)
※ 編輯: cocoon121 來自: 140.130.97.175 (02/18 14:36)
1F：推 stanley300:ECL kit沒擦乾淨?? 02/18 14:42
2F：→ cocoon121:我都是把它另外拿到另一片的盒子反應說... 02/18 14:44
3F：推 alaric:agree一樓, 問題出在ECL呈色. 可能沒有乾就壓片.. 02/18 17:10
4F：→ alaric:你可以考慮把Transfer好的membrane拿去呈色,看看有無下雨痕 02/18 17:12
5F：推 leoblack:PBST可的TBST就可~TBST比PBST還要來得gentle~ 02/18 17:15
6F：→ leoblack:不過你的buffer pH質正確嘛!? 02/18 17:17
7F：→ leoblack:另外~感覺你transfer的時間有點短,安培數有點低耶~濕式? 02/18 17:18
8F：→ cocoon121:是在blockING之後嗎???我之前有過把壓過的用stripping 02/18 17:26
9F：→ cocoon121:然後去呈色 是空白的 然後在押抗體 又出現雨痕 orz 02/18 17:26
10F：→ cocoon121:你是指 製膠的buffer??可是我跑SDS很乾淨說@@雜質會TRAN 02/18 17:28
11F：→ cocoon121:過去嗎???那為什麼SDS是乾淨的阿!? 02/18 17:28
12F：→ cocoon121:用SEMI DRY (BIO-RED)BF 的PH我會去測看看 02/18 17:29
13F：→ cocoon121:忘了說 每次都有把TRAN後的GEL染色 都空空如也! 02/18 17:49
14F：推 alaric:看來是Western內的一個步驟出問題, 和lab其他人比較差別. 02/18 19:51
15F：推 kirby0415:我也出現過很多次...我們老師是說我製膠的玻片不乾淨 02/18 20:30
16F：→ kirby0415:我自己也不曉得為什麼會這樣,個人認為很隨機...>"< 02/18 20:30
17F：推 kirby0415:可能製膠過程出問題吧?! 02/18 20:33
18F：推 blence:雖然我不知道怎麼解決,但上面解釋似乎都充分,我習慣剪多條, 02/18 20:59
19F：→ blence: 不 02/18 20:59
20F：→ blence:這種情形通常只固定某幾支Ab才會,而且不是每次,所有Ab除了 02/18 21:02
21F：→ blence:一抗差異,不管是ECL,實驗條件,gel%或品質,同批實驗一定相同 02/18 21:04
22F：推 blence:後來都是以降低Ab濃度的方式,減少這類的問題發生 02/18 21:14
23F：→ cocoon121:可是要是降低抗體濃度....band我不確定會不會看到耶... 02/18 21:32
24F：→ cocoon121:因為是用客製化抗體的公司建議的比例 02/18 21:32
25F：→ cocoon121:我配過三次抗體 三次都有 像你說的 很隨機 因為我做了 02/18 21:33
26F：→ cocoon121:七八次 有兩次沒有 = =|| 02/18 21:33
27F：→ cocoon121:膠片阿....我明天還要跑四片 我在把它仔細擦過好了... 02/18 21:34
28F：推 tsubasawolfy:有二次沒有....會不會是沒有Ab來的時候你們沒有回溶 02/18 23:59
29F：→ tsubasawolfy:完全 或者是保存條件不好造成Antibody aggregation? 02/18 23:59
30F：推 tsubasawolfy:不過aggregation也不會如此的直..第二個懷疑是你們的 02/19 00:05
31F：→ tsubasawolfy:running buffer該不會一直重複用 使的之前跑進buffer 02/19 00:06
32F：→ tsubasawolfy:理的微量蛋白也跑進膠裡 這些是CB染色看不到的(靈敏 02/19 00:07
33F：→ tsubasawolfy:度低的CB=3= 用silver搞不好就看的到) 02/19 00:08
34F：→ cocoon121:抗體應該不會回容不完全 從抗體來到現在 我一解凍就全 02/19 07:12
35F：→ cocoon121:分裝 之後都是要配新抗體拿一小管 RUNNING BF 我們外圍 02/19 07:13
36F：→ cocoon121:適用舊的 可是每次用過都會有新的 混在一起 但內圍一定 02/19 07:14
37F：→ cocoon121:是新鮮配置....這底我今天會用全新的試看看 02/19 07:15
38F：推 soceress:之前有一段時間我們lab也遇到同樣的問題,結果是一抗的關 03/06 15:32
39F：→ soceress:係.. 同一片strip後再染別的抗體就沒事..最後我們換一抗 03/06 15:33
40F：→ soceress:就再也沒問題~ 可以的話想辦法換掉吧~換一家客製化抗體 03/06 15:34