作者cocoon121 (湛蓝)
看板Biotech
标题[求救] Western bolt有下雨痕
时间Wed Feb 18 14:20:55 2009
大家好 我目前在做WB 所以以下有几个问题想请教大家
首先我先付上我跑的条件
transfer 250 mA 55 min
blocking 室温 1hr 以上 (5%牛奶 in 1X TBST)
wash 3 次 每次15分钟以上
一抗 (1:500) O/N
wash 3 次 每次15分钟以上
二抗 (1:2000) 1hr
wash 3 次 每次15分钟以上
ECL呈色
我先付上我单跑SDS-PAGE的图
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=azureblue&b=12&f=1051429584&p=3
整个PAGE也只有我要的BAND 分子量也对
可是 TRAN後我根据以上的条件去做
图变成这样><
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=azureblue&b=12&f=1051423799&p=0
有BAND没错 可是有下雨痕....
老师是说我WASH没做好 可我後面再做 还是都有耶@@
做了好几次都这样.....有嚐试过抗体浓度改变 可有还是有 囧
我和学姊讨论是想说会不会是一抗本来就是这样
因为我的一抗是客制化抗体.....所以他来的时候是兔子血清
本来是想说 血清里面很杂 是不是有其他杂七杂八的蛋白质在里面
然後我就打电话去问产专
产专说 她觉得是我的blocking buffer 出问题
可是 我们家 blocking buffer 现配 自己要用的自己配
1X TBST 也是新鲜的 平均 一天半用掉1L(公用 BUFFER)
重点是 我们实验室其他人跑都没这个问题 = =|||
我现在跑的是plant protein
我之前有拿别人的sample跑 OK (别人的sample是 cell line)
我以前跑其他植物蛋白的WB也没这个问题@@
所以技术上应该是OK
所以想请教看看 有人知道这个直线条的下雨痕是怎麽一回事吗???
是5%不对?还是我要用PBST?????
可 PBST和TBST有什麽样的差别呢???
ps 有嚐试过室温下两小时 可也是有下雨痕迹><
还有一个问题ㄚ 有一次我忘记把PVDF膜裁切
然後 去呈色 发现他在高分子量的部份也有BAND耶
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=azureblue&b=12&f=1051423801&p=2
可是 SDS-PAGE出来是没有的阿 = =|||||
请问有人知道是为什麽吗????
谢谢
--
※ 编辑: cocoon121 来自: 140.130.97.175 (02/18 14:35)
※ 编辑: cocoon121 来自: 140.130.97.175 (02/18 14:36)
1F：推 stanley300:ECL kit没擦乾净?? 02/18 14:42
2F：→ cocoon121:我都是把它另外拿到另一片的盒子反应说... 02/18 14:44
3F：推 alaric:agree一楼, 问题出在ECL呈色. 可能没有乾就压片.. 02/18 17:10
4F：→ alaric:你可以考虑把Transfer好的membrane拿去呈色,看看有无下雨痕 02/18 17:12
5F：推 leoblack:PBST可的TBST就可~TBST比PBST还要来得gentle~ 02/18 17:15
6F：→ leoblack:不过你的buffer pH质正确嘛!? 02/18 17:17
7F：→ leoblack:另外~感觉你transfer的时间有点短,安培数有点低耶~湿式? 02/18 17:18
8F：→ cocoon121:是在blockING之後吗???我之前有过把压过的用stripping 02/18 17:26
9F：→ cocoon121:然後去呈色 是空白的 然後在押抗体 又出现雨痕 orz 02/18 17:26
10F：→ cocoon121:你是指 制胶的buffer??可是我跑SDS很乾净说@@杂质会TRAN 02/18 17:28
11F：→ cocoon121:过去吗???那为什麽SDS是乾净的阿!? 02/18 17:28
12F：→ cocoon121:用SEMI DRY (BIO-RED)BF 的PH我会去测看看 02/18 17:29
13F：→ cocoon121:忘了说 每次都有把TRAN後的GEL染色 都空空如也! 02/18 17:49
14F：推 alaric:看来是Western内的一个步骤出问题, 和lab其他人比较差别. 02/18 19:51
15F：推 kirby0415:我也出现过很多次...我们老师是说我制胶的玻片不乾净 02/18 20:30
16F：→ kirby0415:我自己也不晓得为什麽会这样,个人认为很随机...>"< 02/18 20:30
17F：推 kirby0415:可能制胶过程出问题吧?! 02/18 20:33
18F：推 blence:虽然我不知道怎麽解决,但上面解释似乎都充分,我习惯剪多条, 02/18 20:59
19F：→ blence: 不 02/18 20:59
20F：→ blence:这种情形通常只固定某几支Ab才会,而且不是每次,所有Ab除了 02/18 21:02
21F：→ blence:一抗差异,不管是ECL,实验条件,gel%或品质,同批实验一定相同 02/18 21:04
22F：推 blence:後来都是以降低Ab浓度的方式,减少这类的问题发生 02/18 21:14
23F：→ cocoon121:可是要是降低抗体浓度....band我不确定会不会看到耶... 02/18 21:32
24F：→ cocoon121:因为是用客制化抗体的公司建议的比例 02/18 21:32
25F：→ cocoon121:我配过三次抗体 三次都有 像你说的 很随机 因为我做了 02/18 21:33
26F：→ cocoon121:七八次 有两次没有 = =|| 02/18 21:33
27F：→ cocoon121:胶片阿....我明天还要跑四片 我在把它仔细擦过好了... 02/18 21:34
28F：推 tsubasawolfy:有二次没有....会不会是没有Ab来的时候你们没有回溶 02/18 23:59
29F：→ tsubasawolfy:完全 或者是保存条件不好造成Antibody aggregation? 02/18 23:59
30F：推 tsubasawolfy:不过aggregation也不会如此的直..第二个怀疑是你们的 02/19 00:05
31F：→ tsubasawolfy:running buffer该不会一直重复用 使的之前跑进buffer 02/19 00:06
32F：→ tsubasawolfy:理的微量蛋白也跑进胶里 这些是CB染色看不到的(灵敏 02/19 00:07
33F：→ tsubasawolfy:度低的CB=3= 用silver搞不好就看的到) 02/19 00:08
34F：→ cocoon121:抗体应该不会回容不完全 从抗体来到现在 我一解冻就全 02/19 07:12
35F：→ cocoon121:分装 之後都是要配新抗体拿一小管 RUNNING BF 我们外围 02/19 07:13
36F：→ cocoon121:适用旧的 可是每次用过都会有新的 混在一起 但内围一定 02/19 07:14
37F：→ cocoon121:是新鲜配置....这底我今天会用全新的试看看 02/19 07:15
38F：推 soceress:之前有一段时间我们lab也遇到同样的问题,结果是一抗的关 03/06 15:32
39F：→ soceress:系.. 同一片strip後再染别的抗体就没事..最後我们换一抗 03/06 15:33
40F：→ soceress:就再也没问题~ 可以的话想办法换掉吧~换一家客制化抗体 03/06 15:34