作者tsk (:~)
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標題[求救] 關於小分子蛋白的western blot
時間Mon Feb 16 22:06:15 2009
請問一下板上的先進們
我有一個target protein 他分子量只有6kD左右
在跑western的時候總是看不到小分子的蛋白質
因為total protein是從組織粹出來的 所以比較雜
就想說用15%的膠來跑
可是transfer後就都hybrid不到 15kD以下的蛋白都很乾淨 囧
想問是不是transfer的問題
我做的條件是
running是用80V 然後換120V...大概跑個1~2小時
transfer 100mA overnight或250mA 3hr 在4度c冰箱中操作
PVDF membrane是0.2um的孔徑
blocking 5% non-fat milk overnight 4度c
wash
1抗 500倍到5000倍都試過了@@ 1抗應該是沒問題 因為我IHC做得出來
wash
2抗 5000倍
wash
壓片...
結果出來...15kD以上的雜band是看得到 可是以下的band就很乾淨.....
應該不是跳海的關係啦@@ 因為marker都還看得到
請問這是出了什麼問題呢? 嗚 我已經快失去信心了
還請各位大哥大姊幫我找到問題的所在>"<
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.84.124
1F：推 turtle24:嗯...說不定target protein根本不存在 偶爾會有這種事 02/16 22:28
不過我做IHC是看得到蛋白的 所以我在懷疑是不是target protein濃度低
所以看不到東西 IHC用Avidin-biotin Complex 所以放大訊號才看到
2F：推 cocoon121:如果跑20%????或是 不要跑到底??? 02/16 22:33
3F：→ cocoon121:我目前跑的試看15左右的位置 我跑15% 他大概在整片GEL 02/16 22:33
4F：→ cocoon121:的後1/3 但是我的MARKE有看到10...(可我沒有跑的很底) 02/16 22:34
我跑的位置也差不多 可是我就是看不到啊 嗚
5F：推 pettra:20%跑的下去嗎？ 試試看tricin PAGE 可能比較好 02/16 22:48
嗯嗯 我來試試tricin好了T_T
6F：推 pettra:還有 你有放positive control嗎？這樣可以確定技術沒問題 02/16 23:04
我的positive control有放 不過也是沒看到耶...
會不會是我gel running的時候溫度太高 斷光了啊@@ 跑SDS-PAGE在低溫跑會比較好嗎
嗚哦 我的問題好多>"<
7F：推 Badina:transfer的時間要縮短 免的trans過頭蛋白跑掉了 02/16 23:52
嗯嗯 這個我會注意 下次做我縮短時間
8F：推 leoblack:有沒有考慮試試gradient gel?! 02/17 00:31
有考慮過...不過可能是非不得以才會用 因為不太會做 用買的也不便宜>"<
9F：推 witchs:用tricin PAGE...我以前跑過6~3KD的 不過要注意配方和濃度 02/17 10:59
10F：→ witchs:更正：Tricine-SDS-PAGE system 02/17 10:59
11F：→ witchs:running Volt 剛開始慢 之後要用衝的.. 02/17 11:05
嗯嗯 了解 感謝啊^^ 我來試看看tricine如何 再上來跟大家報告XD
12F：推 st92013:我也覺得是transfer的時間太長 我常用的是400mA 2.5hr 02/17 14:35
明天我試試把時間縮短 希望可以跑得出來 XD 不過400mA會不會太強啊
因為我沒試過400的^^"
※ 編輯: tsk 來自: 140.112.84.124 (02/17 18:33)
13F：推 kshsdeck:transfer過頭 電流調小或時間縮短 02/18 21:38