作者tsk (:~)
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标题[求救] 关於小分子蛋白的western blot
时间Mon Feb 16 22:06:15 2009
请问一下板上的先进们
我有一个target protein 他分子量只有6kD左右
在跑western的时候总是看不到小分子的蛋白质
因为total protein是从组织粹出来的 所以比较杂
就想说用15%的胶来跑
可是transfer後就都hybrid不到 15kD以下的蛋白都很乾净 囧
想问是不是transfer的问题
我做的条件是
running是用80V 然後换120V...大概跑个1~2小时
transfer 100mA overnight或250mA 3hr 在4度c冰箱中操作
PVDF membrane是0.2um的孔径
blocking 5% non-fat milk overnight 4度c
wash
1抗 500倍到5000倍都试过了@@ 1抗应该是没问题 因为我IHC做得出来
wash
2抗 5000倍
wash
压片...
结果出来...15kD以上的杂band是看得到 可是以下的band就很乾净.....
应该不是跳海的关系啦@@ 因为marker都还看得到
请问这是出了什麽问题呢? 呜 我已经快失去信心了
还请各位大哥大姊帮我找到问题的所在>"<
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.84.124
1F：推 turtle24:嗯...说不定target protein根本不存在 偶尔会有这种事 02/16 22:28
不过我做IHC是看得到蛋白的 所以我在怀疑是不是target protein浓度低
所以看不到东西 IHC用Avidin-biotin Complex 所以放大讯号才看到
2F：推 cocoon121:如果跑20%????或是 不要跑到底??? 02/16 22:33
3F：→ cocoon121:我目前跑的试看15左右的位置 我跑15% 他大概在整片GEL 02/16 22:33
4F：→ cocoon121:的後1/3 但是我的MARKE有看到10...(可我没有跑的很底) 02/16 22:34
我跑的位置也差不多 可是我就是看不到啊 呜
5F：推 pettra:20%跑的下去吗？ 试试看tricin PAGE 可能比较好 02/16 22:48
嗯嗯 我来试试tricin好了T_T
6F：推 pettra:还有 你有放positive control吗？这样可以确定技术没问题 02/16 23:04
我的positive control有放 不过也是没看到耶...
会不会是我gel running的时候温度太高 断光了啊@@ 跑SDS-PAGE在低温跑会比较好吗
呜哦 我的问题好多>"<
7F：推 Badina:transfer的时间要缩短 免的trans过头蛋白跑掉了 02/16 23:52
嗯嗯 这个我会注意 下次做我缩短时间
8F：推 leoblack:有没有考虑试试gradient gel?! 02/17 00:31
有考虑过...不过可能是非不得以才会用 因为不太会做 用买的也不便宜>"<
9F：推 witchs:用tricin PAGE...我以前跑过6~3KD的 不过要注意配方和浓度 02/17 10:59
10F：→ witchs:更正：Tricine-SDS-PAGE system 02/17 10:59
11F：→ witchs:running Volt 刚开始慢 之後要用冲的.. 02/17 11:05
嗯嗯 了解 感谢啊^^ 我来试看看tricine如何 再上来跟大家报告XD
12F：推 st92013:我也觉得是transfer的时间太长 我常用的是400mA 2.5hr 02/17 14:35
明天我试试把时间缩短 希望可以跑得出来 XD 不过400mA会不会太强啊
因为我没试过400的^^"
※ 编辑: tsk 来自: 140.112.84.124 (02/17 18:33)
13F：推 kshsdeck:transfer过头 电流调小或时间缩短 02/18 21:38