※ 引述《cattailizu (眼睛一瞇瞇)》之銘言： : 對不起 問這個問題有點蠢 : 因為一直抽同學的血來做實驗 對他很不好意思 : 以下有幾個問題，希望有經驗的人可以幫忙回答一下 : 1.PBMC算是初代細胞嗎? : 之前有去上過細胞培養的課裡 : 老師有說 有些初代細胞可以繼代個4-8代，甚至有的細胞可以到12代 : 不知道有沒有人養過PBMC繼代的 或者是有哪些方法可以讓他增生或是活久一點 : 假設用不含任何營養物質的RPMI-1640養的話 : 大約可以活多久呢? PBMC算是primary cell PBMC是由monocyte, lymphocyte組成 通常來說，在一般的環境下(RPMI-1640 10%FBS)培養下 monocyte(貼附在dish底部)可以活比較久，大約ㄧ兩個星期沒問題 lymphocyte(漂浮在medium中)存活時間比較短，可能只有一個星期左右 要讓PBMC增生的方法有很多 例如用 PHA 刺激lymphocyte活化 你就可以拿到大量增生的lymphocyte 不過這個方法已經讓lymphocyte〝活化〞了 可能要視您的實驗目的而有所斟酌 : 2.計數的問題 : 因為是抽同學的血 一個人大約10-14mL : 可是用細球計數器總覺得不到2*10次方的細胞(/mL) : 這樣的數目是合理的嗎? 這裡的〝計數〞有點問題 以正常人而言，1uL的全血中大約有4000-10000顆白血球 換句話說，濃度大約在 4 ~ 10 x 10^6/mL monocyte約佔周邊血液白血球的10%左右 lymphocyte較多，大概佔30~40% 因此，假設您是拿 10 mL 的全血取PBMC(約佔白血球的50%)計數 應有 2~5 x 10^7個細胞 : 計數的時候 連小粒的細胞也要數嗎 : 我主要是數比較大顆的?這樣做法是不是不對阿 這個問題牽涉到血球的型態學 有時候會因為分離的技術不純熟、或是試劑、溫度的問題 導致分離的PBMC不夠純 這時候可能會參雜一些紅血球、血小板或是嗜中性白血球 前面兩種血球的大小明顯比較小，所以應該蠻好區分的 比較麻煩的是嗜中性白血球的混雜 建議你可以改用Turk染色法(染細胞核) 可以分出單核(PBMC)與多核(嗜中性白血球)的差異 可以幫助你更準確地計算PBMC : 3.看paper裡有人會加10%的FBS在RPMI-1640裡去養(但也有人不加) : 因為ELISA會因為血清的存在或是脂質會影響分析結果 : 所以目前不太趕加FBS 但是分析IL-4跟IFN-r結果都怪怪的 : 會是因為不加FBS把血球們餓死的原因嗎? : 以上希望有經驗的大大給我點建議 : 謝謝你們 以不含FBS的medium培養lymphocyte 基本上就是在誘發 lymphocyte發生apoptosis (serum starvation) 如果只是短期應該還可以 要長期觀察或是培養就不建議了 以上是小弟的一點心得 可以請有經驗的版友幫忙指正，謝謝 -- 我不想在球場上當一個沒用的人 也許我真得不是很厲害 再練下去也只有這樣子... 可是.......我就是會認真地去練習 賭賭看明天會不會變強一點... --

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