作者BaMV (我一個人住)
看板Biotech
標題[求救] TRIZOL 抽 Plant Total RNA 量太低
時間Wed Jan 28 13:43:20 2009
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
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1. 秤重 0.1 g (頂多增加到 1.5 g). 放入Tube中. 再放入液態氮中
2. 自液態氮中取出 Tube，磨碎後先加300 μl TRIZOL vortex,
再加700 μl TRIZOL
# 我也用過研缽磨成粉後，把粉末取出來秤重，再加TRIZOL，
但濃度還是一樣低，不知道是不是動作不夠快
3. RT／15 min, 12,000 x 15 min x 4℃
4. 加 200 μl Chloroform. shake 15-30 s, 12,000 g x 15 min x 4℃
5. 加 0.5 ml isopropanel, RT／10 min
6. 12,000 g x 10 min x 4℃ 留pellet.
7. 加 1 mL 75% EtOH Wash. (可vortex讓pellet漂浮)
8. 7,500 g x 5 min x 4℃, 抽掉 EtOH
9. Air – Dry／10 min
10. 加 20 μl ddH2O (50℃), 回溶 20 min, 測 OD值
11. 取 10 μg Total RNA (最少) + 10X Buffer (TURBO) + DNase 1 μl + ddH2O，
Total Volume 25 μl, 37℃ / 30 min
12. 加 2.5 μl inactivation buffer (TURBO), RT／2 min
13. 10,000 g x 2 min x 4℃, 取上層到 new Tube 中, 測 OD值
14. 合成 cDNA (因為濃度太低，所以沒有往下做)
感謝大家耐心看完，如果有任何建議，麻煩也寫在版上或寫信給我
這個步驟停了好久，有點糟糕
也祝大家
新年快樂
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.154.103
1F：推 sunnyting:RNA量太低多是因為 原本量就低(植物?部位?年紀?) 01/28 23:03
2F：→ sunnyting:或是degrated了(第一步驟感覺會回潤 過程RNase污染?) 01/28 23:03
3F：推 aggaci:濃度高低跟是否degradation無關係吧...測OD是測嘌呤跟嘧啶 01/29 18:30
4F：→ aggaci:的共振結構.. 01/29 18:30
5F：→ aggaci:我沒抽過植物的RNA但我猜會不會是因為細胞壁破壞效率不高? 01/29 18:32
6F：推 onlyone0419:做RT的酵素我記得敏感度超大，隨便做都做的出來@@a 01/29 19:59
7F：推 kpp: 植物有些部位不容易抽取 如果多醣太多會干擾實驗 01/30 13:16
8F：推 dankai:你們實驗室有人用這個方法跟你抽一樣的sample出來過嗎!?如 01/30 13:26
9F：→ dankai:果有可能是手法上問題~ 如果只有你試~而且一直存在相同問題 01/30 13:27
10F：→ dankai:不如換個protocol去做~你可以試試看CTAB~ 01/30 13:28