作者BaMV (我一个人住)
看板Biotech
标题[求救] TRIZOL 抽 Plant Total RNA 量太低
时间Wed Jan 28 13:43:20 2009
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章----
1. 秤重 0.1 g (顶多增加到 1.5 g). 放入Tube中. 再放入液态氮中
2. 自液态氮中取出 Tube，磨碎後先加300 μl TRIZOL vortex,
再加700 μl TRIZOL
# 我也用过研钵磨成粉後，把粉末取出来秤重，再加TRIZOL，
但浓度还是一样低，不知道是不是动作不够快
3. RT／15 min, 12,000 x 15 min x 4℃
4. 加 200 μl Chloroform. shake 15-30 s, 12,000 g x 15 min x 4℃
5. 加 0.5 ml isopropanel, RT／10 min
6. 12,000 g x 10 min x 4℃ 留pellet.
7. 加 1 mL 75% EtOH Wash. (可vortex让pellet漂浮)
8. 7,500 g x 5 min x 4℃, 抽掉 EtOH
9. Air – Dry／10 min
10. 加 20 μl ddH2O (50℃), 回溶 20 min, 测 OD值
11. 取 10 μg Total RNA (最少) + 10X Buffer (TURBO) + DNase 1 μl + ddH2O，
Total Volume 25 μl, 37℃ / 30 min
12. 加 2.5 μl inactivation buffer (TURBO), RT／2 min
13. 10,000 g x 2 min x 4℃, 取上层到 new Tube 中, 测 OD值
14. 合成 cDNA (因为浓度太低，所以没有往下做)
感谢大家耐心看完，如果有任何建议，麻烦也写在版上或写信给我
这个步骤停了好久，有点糟糕
也祝大家
新年快乐
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.154.103
1F：推 sunnyting:RNA量太低多是因为 原本量就低(植物?部位?年纪?) 01/28 23:03
2F：→ sunnyting:或是degrated了(第一步骤感觉会回润 过程RNase污染?) 01/28 23:03
3F：推 aggaci:浓度高低跟是否degradation无关系吧...测OD是测嘌呤跟嘧啶 01/29 18:30
4F：→ aggaci:的共振结构.. 01/29 18:30
5F：→ aggaci:我没抽过植物的RNA但我猜会不会是因为细胞壁破坏效率不高? 01/29 18:32
6F：推 onlyone0419:做RT的酵素我记得敏感度超大，随便做都做的出来@@a 01/29 19:59
7F：推 kpp: 植物有些部位不容易抽取 如果多醣太多会干扰实验 01/30 13:16
8F：推 dankai:你们实验室有人用这个方法跟你抽一样的sample出来过吗!?如 01/30 13:26
9F：→ dankai:果有可能是手法上问题~ 如果只有你试~而且一直存在相同问题 01/30 13:27
10F：→ dankai:不如换个protocol去做~你可以试试看CTAB~ 01/30 13:28