作者xareelee (XareeLee)
看板Biotech
標題[求救] TRIzol抽RNA時 想要去除DNA
時間Mon Jan 19 21:12:59 2009
以前有用TRIzol抽過RNA 都是酒精沈澱回溶後 測完OD才加入DNase I
可是最近想要簡化流程（省時間並減少RNA損失） 又想要確保沒有DNA殘留
不知道下面步驟能不能使用？ 請大家看看提供一下意見？
1.將菌液離心後，使菌塊溶解於TRIzol(1 mL)當中，充分均質並放置15 min
2.加入chloroform(0.2 mL)後，混合均勻並放置5 min
3.離心後小心吸取上層的上清液（約540 uL)
4.加入DNase I(量可能要抓） <====新增步驟
5.重新phenol/chloroform和離心取上清去除protein <====新增步驟
6.isopropanol沈澱RNA，離心取得RNA pellet
7.用75% ethanol清洗，離心後乾燥RNA pellet
8.回溶於DEPC-treated water，測OD260&280
9.RNA gel確定RNA品質，同時進行RT取得cDNA進行保存。
這樣應該可以確保沒有gDNA殘留，並且可以加快實驗步驟
這樣可行嘛？
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◆ From: 140.129.77.13
※ 編輯: xareelee 來自: 140.129.77.13 (01/19 21:14)
1F：推 Ice9:嗯，看樣子，你們 Lab 應該挺有錢的。DNase，我們一般不在那 01/19 23:03
2F：→ Ice9:時候加...... 01/19 23:03
3F：推 sharkcell:恩~這樣做應該要加比原本多快10倍的DNase量吧 01/19 23:11
4F：推 hek:你第四步DNAse就死光啦,怎麼去的掉 01/19 23:13
5F：推 untilnow:DNase:幹！ 01/20 00:24
6F：→ sunnyting:樓上...囧... 01/20 09:45
7F：推 sunnyting:1>2>3>6>7>8+確認品質>4>再測一次OD>合成cDNA 01/20 09:52
8F：→ sunnyting:DNase用量請參考說明書 一定量的sample+一定量的DNase 01/20 09:53
9F：→ sunnyting:我也是抽植物 用量在0.5~1 micro-g之間 01/20 09:55
10F：推 sunnyting:還有 不見得每次都要用DNase 你可以跑個PCR檢查一下有無 01/20 09:57
11F：→ sunnyting:genomic DNA殘留 因為若要microarry的就不能加DNase 01/20 09:58
12F：→ sunnyting:又打錯字....microarray囧 01/20 09:59
13F：推 zoom8080:第3步犧牲一些 不要抽太靠近分層的地方就OK 01/20 10:19
14F：推 choroplast:依照我們實驗室的protocol 第三步的時候 只取400ul 01/20 17:58
15F：→ choroplast:而且在取的時候 盡量不要吸到中間的白色沈澱物 01/20 18:00
16F：→ xareelee:所以說 正常的TRIzol抽取 不會有genomic DNA殘留囉？ 01/21 15:58
17F：推 zoom8080:加氯仿離完新以後要避免晃到 這樣水層應該不會有DNA 01/22 03:21
18F：推 Ice9:不是不會留有 DNA 殘留，而是其量可以減少很多很多。 01/22 18:58