作者jingyi620 (平淡 超凡品味!)
看板Biotech
標題[求救] RNase 加入的時機
時間Sun Jan 18 17:50:26 2009
最近再抽植物(多醣體很多)的DNA
剛開始是依照實驗室給的步驟 (CTAB) 方式抽取
不過產量一直不是很高 >"< 被老闆嫌棄
此方法跟我在很多書上看到的最大不同處是RNase加入的時機以及分量....
我先po一下步驟
1.取CTAB extraction buffer + PVPP + B-Me 65度c預熱1小時
2.將粉末狀的樣品倒入步驟1.所配置的 buffer 並加入50ul RNase (10mg/ml) 與
75ul Protase (20mg/ml) 混合均勻後至於65度c反應1小時
3.加入等量CIA離心
今天~剛剛加入異丙醇得到的量超少 =口= 沒有麵線狀的產物出現......
與我前天沒有加入RNase與Protase 的結果差很多~
加入異丙醇後可看見很多絲狀物 ~ 糾結在一起
所以我一直認為~是RNase的關係....
我看到的都是在經過CIA處理後 才加入~
不過還沒跟老闆討論 = = 因為一分證據說一分話....
他一直覺得是我實驗手法的問題 =口= (我進實驗室6個月)
到底 >"< .....
而且......學長有說過~PVPP會與.....結合.... 導至DNA...... 我沒聽清楚 ~囧
哪位好心人可以給我建議嗎? T^T 感激不盡~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.190.74
1F：推 dankai:你的方法好像只是粗萃取...後面沒了嗎!? isp加入之後的絲 01/18 18:06
2F：→ dankai:狀物是DNA~ 我們家RNase加的時機在isp之後~重新回溶DNA時加 01/18 18:08
3F：→ dankai:pvpp移除酚類化合物~避免影響DNA品質!! 01/18 18:09
4F：→ dankai:還有一個原因...你樣品真的磨的夠碎嗎!!這也是可能發生的~ 01/18 18:11
5F：→ jingyi620:後面步驟還有~只是我寫下我有疑惑的地方..... 01/18 19:44
6F：→ jingyi620:要怎麼判斷樣本磨得夠不夠碎~ 學長說要像奶粉一樣 ~"~ 01/18 19:45
7F：→ jingyi620:後面的步驟是 CTAB/NaCl→CTAB 沉澱液→ 離心→高鹽TE→ 01/18 19:48
8F：→ jingyi620:+ isp→ 離心 →80%酒精清洗→回溶→測O.D 01/18 19:50
9F：→ jingyi620:RNase的量真的不會太多嗎? 學姐說因為是在前面加~ 01/18 19:51
10F：→ jingyi620:雜質比較多~所以量要用多一點 01/18 19:52
11F：推 sGoat:請問一下你為何覺得影響產量是RNase的緣故? 01/19 11:17
12F：→ sGoat:另外你好像缺寫樣品秤多少量去加入50ul RNase... 01/19 11:19
13F：推 sGoat:樣品體積跟濃度都會影響加下去時的外觀,另外你是用生長旺盛 01/19 11:25
14F：→ sGoat:時期的樣品還是有點老化的樣品也會影響DNA量... 01/19 11:25
15F：→ sGoat:RNase在理論上及我CTAB使用的經驗來看是沒有影響... 01/19 11:26
16F：推 davideason:buffer 跟 sample 比 不要太低 01/19 13:52
17F：推 wt1seven:抽那麼多DNA做什麼用？ 往後要做的實驗作的出來就好好 01/19 17:39
18F：→ wt1seven:用KIT輔助也可，每個數據要求完美是沒意義的。。 01/19 17:41
19F：推 meganfox:老闆通常要求完美.....這是最大的問題!!! 01/19 20:57
20F：→ meganfox:RNase應該是不會影響DNA的量...主要是樣品本身的問題! 01/19 20:58
21F：→ meganfox:是不是幼嫩新生組織..或者是像你老闆說的手法~不夠碎 01/19 21:00
22F：→ jingyi620:每個人聽到我加50ul~都被嚇到 = = sample取幼嫩的葉子 01/20 01:43
23F：→ jingyi620:還有~我看最初的書上是沒有加RNase所以我才覺得是這問題 01/20 01:46
24F：→ jingyi620:我知道小的完整幼葉與大片老葉的細胞數是一樣多~ 01/20 01:48
25F：推 vm04:石頭的石？叔頭的叔 01/22 11:41
26F：→ jingyi620:居然會遇到熟人..... = = 01/22 21:28