作者jingyi620 (平淡 超凡品味!)
看板Biotech
标题[求救] RNase 加入的时机
时间Sun Jan 18 17:50:26 2009
最近再抽植物(多醣体很多)的DNA
刚开始是依照实验室给的步骤 (CTAB) 方式抽取
不过产量一直不是很高 >"< 被老板嫌弃
此方法跟我在很多书上看到的最大不同处是RNase加入的时机以及分量....
我先po一下步骤
1.取CTAB extraction buffer + PVPP + B-Me 65度c预热1小时
2.将粉末状的样品倒入步骤1.所配置的 buffer 并加入50ul RNase (10mg/ml) 与
75ul Protase (20mg/ml) 混合均匀後至於65度c反应1小时
3.加入等量CIA离心
今天~刚刚加入异丙醇得到的量超少 =口= 没有面线状的产物出现......
与我前天没有加入RNase与Protase 的结果差很多~
加入异丙醇後可看见很多丝状物 ~ 纠结在一起
所以我一直认为~是RNase的关系....
我看到的都是在经过CIA处理後 才加入~
不过还没跟老板讨论 = = 因为一分证据说一分话....
他一直觉得是我实验手法的问题 =口= (我进实验室6个月)
到底 >"< .....
而且......学长有说过~PVPP会与.....结合.... 导至DNA...... 我没听清楚 ~囧
哪位好心人可以给我建议吗? T^T 感激不尽~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.190.74
1F：推 dankai:你的方法好像只是粗萃取...後面没了吗!? isp加入之後的丝 01/18 18:06
2F：→ dankai:状物是DNA~ 我们家RNase加的时机在isp之後~重新回溶DNA时加 01/18 18:08
3F：→ dankai:pvpp移除酚类化合物~避免影响DNA品质!! 01/18 18:09
4F：→ dankai:还有一个原因...你样品真的磨的够碎吗!!这也是可能发生的~ 01/18 18:11
5F：→ jingyi620:後面步骤还有~只是我写下我有疑惑的地方..... 01/18 19:44
6F：→ jingyi620:要怎麽判断样本磨得够不够碎~ 学长说要像奶粉一样 ~"~ 01/18 19:45
7F：→ jingyi620:後面的步骤是 CTAB/NaCl→CTAB 沉淀液→ 离心→高盐TE→ 01/18 19:48
8F：→ jingyi620:+ isp→ 离心 →80%酒精清洗→回溶→测O.D 01/18 19:50
9F：→ jingyi620:RNase的量真的不会太多吗? 学姐说因为是在前面加~ 01/18 19:51
10F：→ jingyi620:杂质比较多~所以量要用多一点 01/18 19:52
11F：推 sGoat:请问一下你为何觉得影响产量是RNase的缘故? 01/19 11:17
12F：→ sGoat:另外你好像缺写样品秤多少量去加入50ul RNase... 01/19 11:19
13F：推 sGoat:样品体积跟浓度都会影响加下去时的外观,另外你是用生长旺盛 01/19 11:25
14F：→ sGoat:时期的样品还是有点老化的样品也会影响DNA量... 01/19 11:25
15F：→ sGoat:RNase在理论上及我CTAB使用的经验来看是没有影响... 01/19 11:26
16F：推 davideason:buffer 跟 sample 比 不要太低 01/19 13:52
17F：推 wt1seven:抽那麽多DNA做什麽用？ 往後要做的实验作的出来就好好 01/19 17:39
18F：→ wt1seven:用KIT辅助也可，每个数据要求完美是没意义的。。 01/19 17:41
19F：推 meganfox:老板通常要求完美.....这是最大的问题!!! 01/19 20:57
20F：→ meganfox:RNase应该是不会影响DNA的量...主要是样品本身的问题! 01/19 20:58
21F：→ meganfox:是不是幼嫩新生组织..或者是像你老板说的手法~不够碎 01/19 21:00
22F：→ jingyi620:每个人听到我加50ul~都被吓到 = = sample取幼嫩的叶子 01/20 01:43
23F：→ jingyi620:还有~我看最初的书上是没有加RNase所以我才觉得是这问题 01/20 01:46
24F：→ jingyi620:我知道小的完整幼叶与大片老叶的细胞数是一样多~ 01/20 01:48
25F：推 vm04:石头的石？叔头的叔 01/22 11:41
26F：→ jingyi620:居然会遇到熟人..... = = 01/22 21:28