作者nk12914 (等待)
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標題[求救] 請問用濕式transfer 看E-cadherin??
時間Thu Jan 15 00:58:50 2009
之前實驗室都是用semi-dry的機器transfer
其中一個要看的protein是120kD的E-cadherin
但不知道是哪裡出問題 每次結果都不是很穩定
有的時候整個連control組都沒壓到protein
不然就是壓片結果是一整片霧霧的樣子
transfer完 我們lab都會染FcF先看一下trasfer的結果如何
可是很多時候90kD以上 幾乎都是霧霧的一片
semi-dry的條件是250mA, 2hr
每次要取下membrane的時候 SDS-PAGE其實都已經Q起來了
後來(其實也就是今天)跟別間實驗室借了濕式的機型
條件設定為200mA, 2hr
transfer完，拆掉三明治的組合
membrane上只剩下依稀殘留的marker殘影
染了FcF membrane上一片空白
我很確定組裝順序沒有錯 membrane上也有一些marker的殘存屍體
方向應該是沒錯
請問是我的條件設定錯誤嗎?
已經卡在E-cadherin卡了很久了
想請問有經驗的版友 可以提供我一些建議嗎???
拜託了 能不能畢業就看它了....
先謝謝你們~~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.77.129
1F：推 leoblack:我們家wet transfer都用300 mV,80min~看140kDa的蛋白 01/15 03:02
2F：→ leoblack:另外~semi-dry的用15V,30min(看大protein會到45min) 01/15 03:02
3F：→ leoblack:看你要不要試試看 01/15 03:02
4F：推 wangharry:一樓應該是300mA 01/15 07:26
5F：推 leoblack:sorry打錯~感謝樓上指正~是300mA沒錯 01/15 09:57
6F：推 sakuru:確定這個抗體work嗎? 01/15 18:49
7F：→ nk12914:抗體OK 不過效價是有點弱了....但還OK 01/15 22:09
8F：推 smalleg:transfer buffer methanol的比例是用多少? 01/16 23:35
9F：→ nk12914:20% 01/18 22:09
10F：推 smalleg:試試10% 01/19 21:24