作者nk12914 (等待)
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标题[求救] 请问用湿式transfer 看E-cadherin??
时间Thu Jan 15 00:58:50 2009
之前实验室都是用semi-dry的机器transfer
其中一个要看的protein是120kD的E-cadherin
但不知道是哪里出问题 每次结果都不是很稳定
有的时候整个连control组都没压到protein
不然就是压片结果是一整片雾雾的样子
transfer完 我们lab都会染FcF先看一下trasfer的结果如何
可是很多时候90kD以上 几乎都是雾雾的一片
semi-dry的条件是250mA, 2hr
每次要取下membrane的时候 SDS-PAGE其实都已经Q起来了
後来(其实也就是今天)跟别间实验室借了湿式的机型
条件设定为200mA, 2hr
transfer完，拆掉三明治的组合
membrane上只剩下依稀残留的marker残影
染了FcF membrane上一片空白
我很确定组装顺序没有错 membrane上也有一些marker的残存屍体
方向应该是没错
请问是我的条件设定错误吗?
已经卡在E-cadherin卡了很久了
想请问有经验的版友 可以提供我一些建议吗???
拜托了 能不能毕业就看它了....
先谢谢你们~~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.77.129
1F：推 leoblack:我们家wet transfer都用300 mV,80min~看140kDa的蛋白 01/15 03:02
2F：→ leoblack:另外~semi-dry的用15V,30min(看大protein会到45min) 01/15 03:02
3F：→ leoblack:看你要不要试试看 01/15 03:02
4F：推 wangharry:一楼应该是300mA 01/15 07:26
5F：推 leoblack:sorry打错~感谢楼上指正~是300mA没错 01/15 09:57
6F：推 sakuru:确定这个抗体work吗? 01/15 18:49
7F：→ nk12914:抗体OK 不过效价是有点弱了....但还OK 01/15 22:09
8F：推 smalleg:transfer buffer methanol的比例是用多少? 01/16 23:35
9F：→ nk12914:20% 01/18 22:09
10F：推 smalleg:试试10% 01/19 21:24