作者ayinie (假man超人)
看板Biotech
標題[求救] ligation一直失敗
時間Mon Dec 29 12:38:11 2008
我的insert只有大約60bp左右
要接進去pEGFP-N3(4.7kb)
切位是EcoRI和BamHI
由於insert是直接找生技公司訂製合成的oligonucleotides
所以insert兩端原本就帶有EcoRI和BamHI的sticky end
而pEGFP我是使用上述兩種RE double digestion 2h
再進行切膠回收
使用T4 DNA ligase進行ligation
室溫overnight
問題來了
我試過很多條件總是接不進去!
我原先將insert做10倍稀釋
試過下列兩種條件
insert 2ul + vector 1ul (total 10ul) → 學姐給的protocol
insert 14ul + vector 1ul (total 20ul) → 根據公式計算
公式為[insert]*V1/insert size : [vector]*V2/verctor size = 3:1
而insert和vector的濃度是根據電泳圖大約推測相差幾倍
transform後塗plate只有長2、3個colonies
我全部挑起來抽plasmid再以RE check
結果是失敗！(跑電泳看不到insert band)
跟學姐討論也討論不出所以然來
只長2、3個colonies應該不至於是vector自接吧？！
後來我懷疑會不會是insert濃度太低所以接不進去
(因為insert 10X稀釋後跑電泳出來的band非常非常淡)
我就不把insert做10倍稀釋
直接做ligation
insert 2ul + vector 1ul (total 10ul)
transform後塗plate只有長2、3個colonies
我全部挑起來抽plasmid再以RE check
結果電泳跑出來還是看不到insert的band
最後學姐叫我拿去定序定看看好
今天收到定序單比對後發現真的沒有接進去
從EcoRI到BamHI這段序列是完整的
所以有沒有可能根本沒切開？
但是EcoRI和BamHI很容易切開不是嗎？
對了我在RE digestion後跑電泳是使用2% gel跑15分鐘
使用同樣的條件單跑insert是看得到band
所以不可能是insert太小跑電泳流掉了
懇請指教謝謝！
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◆ From: 140.120.117.206
1F：推 micocat:insert有加PNK處理嗎 ligase是ok的嗎 12/29 13:15
2F：推 tsubasawolfy:分開做RE確定兩個都有作用 vector濃度高的話就切久一 12/29 13:17
3F：→ tsubasawolfy:點 不放心就再加個CIAP防止自接 同時要做沒有加inser 12/29 13:18
4F：→ tsubasawolfy:t的ligation control. 之後再去比較control跟exp之間 12/29 13:19
5F：→ tsubasawolfy:的colony數目就可以初步知道到底有沒有接進去 12/29 13:19
6F：→ tsubasawolfy:如果exp跟con一樣乾乾淨淨就是你ligation的問題了 12/29 13:20
7F：推 yaliu:insert有確定酵素切的下來嗎？切位旁邊記得要預留幾個核甘酸 12/29 14:24
8F：推 yoknowme:你要不要把insert先接上pBlunt送sequence 12/29 20:32
9F：→ yoknowme:送完若正確 再切下來 這樣倒底有沒有切也就很清楚 12/29 20:33
10F：→ yoknowme:還有vector的量要至少20ng左右 再去做1:3~5的比例 12/29 20:35
11F：推 qumai:@@" 我做過類似的 不過insert沒有再稀釋就做了 12/30 20:47
12F：→ qumai:也沒做其他的處理...可以接得起來 vector要切的很乾淨 12/30 20:48
13F：推 qumai:你的vector有沒有已經接進別的長一點的insert的? 12/30 20:50
14F：→ qumai:這樣比較好切 然後挑colony也比較好分辨有沒有換成你要的 12/30 20:51
15F：→ qumai:不然很難只用限制酶確定insert有接進去還是原本的plasmid 12/30 20:52
16F：推 bbiioo:Vector切久點吧!不然就分開切 也切久點 不然很容易切不乾淨 12/31 13:05