作者ayinie (假man超人)
看板Biotech
标题[求救] ligation一直失败
时间Mon Dec 29 12:38:11 2008
我的insert只有大约60bp左右
要接进去pEGFP-N3(4.7kb)
切位是EcoRI和BamHI
由於insert是直接找生技公司订制合成的oligonucleotides
所以insert两端原本就带有EcoRI和BamHI的sticky end
而pEGFP我是使用上述两种RE double digestion 2h
再进行切胶回收
使用T4 DNA ligase进行ligation
室温overnight
问题来了
我试过很多条件总是接不进去!
我原先将insert做10倍稀释
试过下列两种条件
insert 2ul + vector 1ul (total 10ul) → 学姐给的protocol
insert 14ul + vector 1ul (total 20ul) → 根据公式计算
公式为[insert]*V1/insert size : [vector]*V2/verctor size = 3:1
而insert和vector的浓度是根据电泳图大约推测相差几倍
transform後涂plate只有长2、3个colonies
我全部挑起来抽plasmid再以RE check
结果是失败！(跑电泳看不到insert band)
跟学姐讨论也讨论不出所以然来
只长2、3个colonies应该不至於是vector自接吧？！
後来我怀疑会不会是insert浓度太低所以接不进去
(因为insert 10X稀释後跑电泳出来的band非常非常淡)
我就不把insert做10倍稀释
直接做ligation
insert 2ul + vector 1ul (total 10ul)
transform後涂plate只有长2、3个colonies
我全部挑起来抽plasmid再以RE check
结果电泳跑出来还是看不到insert的band
最後学姐叫我拿去定序定看看好
今天收到定序单比对後发现真的没有接进去
从EcoRI到BamHI这段序列是完整的
所以有没有可能根本没切开？
但是EcoRI和BamHI很容易切开不是吗？
对了我在RE digestion後跑电泳是使用2% gel跑15分钟
使用同样的条件单跑insert是看得到band
所以不可能是insert太小跑电泳流掉了
恳请指教谢谢！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.117.206
1F：推 micocat:insert有加PNK处理吗 ligase是ok的吗 12/29 13:15
2F：推 tsubasawolfy:分开做RE确定两个都有作用 vector浓度高的话就切久一 12/29 13:17
3F：→ tsubasawolfy:点 不放心就再加个CIAP防止自接 同时要做没有加inser 12/29 13:18
4F：→ tsubasawolfy:t的ligation control. 之後再去比较control跟exp之间 12/29 13:19
5F：→ tsubasawolfy:的colony数目就可以初步知道到底有没有接进去 12/29 13:19
6F：→ tsubasawolfy:如果exp跟con一样乾乾净净就是你ligation的问题了 12/29 13:20
7F：推 yaliu:insert有确定酵素切的下来吗？切位旁边记得要预留几个核甘酸 12/29 14:24
8F：推 yoknowme:你要不要把insert先接上pBlunt送sequence 12/29 20:32
9F：→ yoknowme:送完若正确 再切下来 这样倒底有没有切也就很清楚 12/29 20:33
10F：→ yoknowme:还有vector的量要至少20ng左右 再去做1:3~5的比例 12/29 20:35
11F：推 qumai:@@" 我做过类似的 不过insert没有再稀释就做了 12/30 20:47
12F：→ qumai:也没做其他的处理...可以接得起来 vector要切的很乾净 12/30 20:48
13F：推 qumai:你的vector有没有已经接进别的长一点的insert的? 12/30 20:50
14F：→ qumai:这样比较好切 然後挑colony也比较好分辨有没有换成你要的 12/30 20:51
15F：→ qumai:不然很难只用限制酶确定insert有接进去还是原本的plasmid 12/30 20:52
16F：推 bbiioo:Vector切久点吧!不然就分开切 也切久点 不然很容易切不乾净 12/31 13:05