作者artery (酸糖果)
看板Biotech
標題[求救] Q-PCR
時間Sun Dec 21 01:01:07 2008
最近在做Q-PCR碰到一些問題，請大家幫忙，謝謝
問題一：
我把磨好的RNA轉成cDNA後
先用一般PCR拿actin當primer
來先確認我的RNA有沒有問題
結果：只有single band
又我的sample是有轉基因跟沒有轉基因的植物
所以我又拿我轉基因的primer去pcr
確定沒有轉基因沒有band，而有轉基因的植物有band
並且都是single band
所以接下來我就直接拿這些sample當template
來進行Q-PCR
看結果是有螢光被偵測到(有被放大)
但是NTC和sample被放大的倍數是一樣的
然後melting curve非常專一(包括NTC都有起來)
然後跑膠之後
NTC是空的
但sample的部份全都smear
請問 這是怎麼一回事？
是不是我的sample有DNA污染？
還是......？
問題二：
我設計一組A gene的primer，預期要p到的大小為200bp
所以我先用一般的pcr進行測試
但不論怎麼p，提高溫度還是什麼的
p到的長度都是450bp左右，並且是single band
但一樣的產物，換另一組B gene當primer進行PCR
得到的結果和預期的大小是一樣的
再換另一組不同的C gene，也和預期大小一樣
請問，A gene那組的primer發生什麼問題？
還是那裡出了問題？
麻煩線上的高手們幫忙解答
這實驗卡了也一陣子了
我想快畢業走人
就剩這個實驗了
請大家幫忙，謝謝
--
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 122.118.34.157
1F：→ artery:忘了說，我是用SYBR GREEN 12/21 01:02
2F：推 bigcat24:有做negative控制組嗎 就是只用RNA做PCR 看有無DNA殘留哩 12/22 09:37
3F：→ artery:有做negative control都沒問題 12/24 11:56