作者surface (陽光宅男~)
看板Biotech
標題[求救] 膜蛋白萃取 用質譜卻定不到膜蛋白
時間Mon Dec 15 18:40:01 2008
最近在麼蛋白萃取上有很大的問題
我用了大部份期刊使用(梯度離心)的方法來萃取肺臟的膜蛋白
但是我送入質譜打卻會定到一堆細胞質的蛋白或是血紅素(但犧牲時有進行灌流及放血)
我的步驟大概如下:
我先將約100mg 的lung tissue
以hypotonic buffer (含有HEPE, NaCl, EDTA, MgCl, Spermine, Spermidine, pH7.4)
以均質機均質後並放在冰上30min使細胞完全破裂
然後再1000g, 10min at 4度 將細胞核及一些細胞碎片等離掉後
再加入surcose(最後surcose濃度為0.25M<變成isotonic>)
接著以 13000g, 1hr, at 4度 將mitochondria (pallet)給離掉
上清液再利用超高速離心(100000g, 2hr at 4度) 將membrane fraction離下來
上清液則為cytosolic fraction
最後pallet再以1% triton in PBS將pallet給溶解之後再做in solution digestion
送質譜
但是現在的問題是會訂到很多血紅素及cytosolic proteins
都訂不到membrane proteins
不知道哪個步驟需要改進,請有經驗的高手給我點意見.
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.61.72
1F：→ jbking:要不要試試看加上sonication 12/16 00:23
2F：推 kwanchi:請問你有沒有先跑WESTERN壓MEMBRANE FRACTION跟CYTO FRAC. 12/18 21:50
3F：→ kwanchi:的MARKER?如沒分乾淨可能會使你的TARGET PROT.量相對下降 12/18 21:52
4F：→ kwanchi:我怕你最後的pellet其實沒有membrane fract就白溶triton了 12/18 21:54