作者surface (阳光宅男~)
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标题[求救] 膜蛋白萃取 用质谱却定不到膜蛋白
时间Mon Dec 15 18:40:01 2008
最近在麽蛋白萃取上有很大的问题
我用了大部份期刊使用(梯度离心)的方法来萃取肺脏的膜蛋白
但是我送入质谱打却会定到一堆细胞质的蛋白或是血红素(但牺牲时有进行灌流及放血)
我的步骤大概如下:
我先将约100mg 的lung tissue
以hypotonic buffer (含有HEPE, NaCl, EDTA, MgCl, Spermine, Spermidine, pH7.4)
以均质机均质後并放在冰上30min使细胞完全破裂
然後再1000g, 10min at 4度 将细胞核及一些细胞碎片等离掉後
再加入surcose(最後surcose浓度为0.25M<变成isotonic>)
接着以 13000g, 1hr, at 4度 将mitochondria (pallet)给离掉
上清液再利用超高速离心(100000g, 2hr at 4度) 将membrane fraction离下来
上清液则为cytosolic fraction
最後pallet再以1% triton in PBS将pallet给溶解之後再做in solution digestion
送质谱
但是现在的问题是会订到很多血红素及cytosolic proteins
都订不到membrane proteins
不知道哪个步骤需要改进,请有经验的高手给我点意见.
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.61.72
1F：→ jbking:要不要试试看加上sonication 12/16 00:23
2F：推 kwanchi:请问你有没有先跑WESTERN压MEMBRANE FRACTION跟CYTO FRAC. 12/18 21:50
3F：→ kwanchi:的MARKER?如没分乾净可能会使你的TARGET PROT.量相对下降 12/18 21:52
4F：→ kwanchi:我怕你最後的pellet其实没有membrane fract就白溶triton了 12/18 21:54