※ 引述《cecik (追隨風那樣)》之銘言： : 最近才開始做western，但是因為身在國外語言障礙很大 : 光是學完wetsern已經耗掉我和那邊唯一勉強會通英文的人的很多體力 : 所以有些網路上查不到的資料只能向版友請教了，希望大家見諒 : 1. 請問大家hybrid inetrnal control (如actin) : 是會跑另一片膠?還是用原來的membrane(看target protein的)striped後再染呢? : (對不起這問題很基本但是我蒐尋一堆關鍵字都找不到...) : 能簡述一下方法嗎? 看你在染一抗的時候會不會切割到mambrane,如果不會切到actin的位置或者是你根 本沒有切membrane,就可以Striped,方法如下: 1.顯影過的membrane TBS-T再wash3次 2.stripping bfr 56oC 處理20~30分鐘 3.TBS-T wash 3次 4.5%脫脂奶粉 in TBST blocking 1 hr (此步驟可以省略,不過效果較差) 5.TBS-T wash 3次 6.再加actinㄧ抗 接下來的作法就如同一般2抗的作法 如果會切到membrane 就要重跑ㄧ片了 : 2. 請問準備sample時，protein extraction要保存是有先經過什麼處理嗎? : 因為很久以前曾經看過別的實驗室protein抽好後去測濃度 : 然後就用sample bf dilute到要做實驗的量，之後全部一起加熱95度後再放-80冰箱 : 現在的實驗室則是抽好後就凍起來，要做才稀釋再加熱 : 這兩種方式是都可以嗎，或是有優劣呢? 我也是抽好測好濃度就凍起來，要做才稀釋再加熱 不過反覆解凍會有protein降解的問題,凍起來前要先分裝~ 如果sample bf dilute到要做實驗的量，之後全部一起加熱95度後再放 -80冰箱,應該也是可以~不過要調整濃度~增量減量的時候可能會有問題 : 3. 請問整隻手伸進去定影劑會有甚麼不良影響嗎? <--這問題大家可以跳過 XD : 因為今天不幸手滑讓底片沉下去只好整隻手下去撈，覺得自己真蠢... : 先謝謝大家了，如果有任何western的建議也歡迎不吝指教，感激 >"< 這題我跳過阿~上帝保佑你! --

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