※ 引述《cecik (追随风那样)》之铭言： : 最近才开始做western，但是因为身在国外语言障碍很大 : 光是学完wetsern已经耗掉我和那边唯一勉强会通英文的人的很多体力 : 所以有些网路上查不到的资料只能向版友请教了，希望大家见谅 : 1. 请问大家hybrid inetrnal control (如actin) : 是会跑另一片胶?还是用原来的membrane(看target protein的)striped後再染呢? : (对不起这问题很基本但是我蒐寻一堆关键字都找不到...) : 能简述一下方法吗? 看你在染一抗的时候会不会切割到mambrane,如果不会切到actin的位置或者是你根 本没有切membrane,就可以Striped,方法如下: 1.显影过的membrane TBS-T再wash3次 2.stripping bfr 56oC 处理20~30分钟 3.TBS-T wash 3次 4.5%脱脂奶粉 in TBST blocking 1 hr (此步骤可以省略,不过效果较差) 5.TBS-T wash 3次 6.再加actinㄧ抗 接下来的作法就如同一般2抗的作法 如果会切到membrane 就要重跑ㄧ片了 : 2. 请问准备sample时，protein extraction要保存是有先经过什麽处理吗? : 因为很久以前曾经看过别的实验室protein抽好後去测浓度 : 然後就用sample bf dilute到要做实验的量，之後全部一起加热95度後再放-80冰箱 : 现在的实验室则是抽好後就冻起来，要做才稀释再加热 : 这两种方式是都可以吗，或是有优劣呢? 我也是抽好测好浓度就冻起来，要做才稀释再加热 不过反覆解冻会有protein降解的问题,冻起来前要先分装~ 如果sample bf dilute到要做实验的量，之後全部一起加热95度後再放 -80冰箱,应该也是可以~不过要调整浓度~增量减量的时候可能会有问题 : 3. 请问整只手伸进去定影剂会有甚麽不良影响吗? <--这问题大家可以跳过 XD : 因为今天不幸手滑让底片沉下去只好整只手下去捞，觉得自己真蠢... : 先谢谢大家了，如果有任何western的建议也欢迎不吝指教，感激 >"< 这题我跳过阿~上帝保佑你! --

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