作者anneychang (anney)
看板Biotech
標題[求救] 用Turbo pfu PCR 做不出來...
時間Tue Dec 2 18:55:53 2008
各位前輩好
我是大三的進實驗室的研究生
這幾天以來我用Turbo pfu polymerase 做pcr卻一直沒有東西
我需要的DNA片段是1.2Kb的大小而且跑完電泳照膠確認後是完全沒東西
只有一堆的primer在下方而已...
我爲了確認是不是primer或是DNA template的問題
所以用另外一個polymerase (go-taq)來做而可以p出一段1.2kb的DNA
其他像是dNTP的濃度或是extention的時間等等的問題也都按照建議的條件去做
我的pcr condition 是:
preheat 94度 2min template 0.5 ul
denaturation 94度 40s ← primer F 0.3 ul
annealing 50度 1min ∣31 cycles primer R 0.3 ul
extention 72度 2'30s — dNTP 10mM 0.5 ul
extra extention 72度 3min 10X buffer 2.5 ul
10度 pause PFU 0.3 ul
ddH2O 20.6 ul
total 體積是25ul
我另外也有上網查資料
有看到turbo pfu polymerase 的溫度條件最低限制是50度
剛好我的annealing的溫度就是50度
請問pcr做不出來會是因為這個原因嗎?
還是是有其他一些我沒有注意到的地方呢?
請有經驗的人或是專家可以幫我解答嗎?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.100.234
1F：推 alaric:實驗室 有學長姊及老師, 不然問廠商吧.. 12/02 19:17
2F：推 jsi:以前使用turbo發現適合的annnealing temp可能會跟其他taq不同 12/02 21:25
3F：→ jsi:可嘗試調整一下溫度 btw,您的turbo pfu確定有活性嗎? 12/02 21:27
4F：推 itoya:不知道你是用strategen的pfu turbo嗎?可以嘗試extention用 12/02 23:54
5F：→ itoya:68度,記得trouble shooting有這個建議,我也嘗試過,有改善! 12/02 23:55
6F：推 slimasai:你的plasmid多大 12/03 23:54
7F：→ slimasai:打錯 是要問vector 12/03 23:54
8F：推 lucidol:template濃度?我有做過case是anneal temp我48度都ok 12/04 18:50
9F：→ anneychang:我的template是細菌的chromosome,濃度大是兩百多ng/ul 12/05 17:30
10F：→ anneychang:然後現在奇怪的是我有4條primer,F1跟R1;F2跟R2 12/05 17:32
11F：→ anneychang:我用F1跟R2 P不出 1.2kb大小的片段,可是用F1,R1 12/05 17:34
12F：→ anneychang:F2跟R2 可以各自P出約500bp的片段,現在就是卡在P不出我 12/05 17:35
13F：→ anneychang:想要的那一段F1,R2夾出的1.2kb的片段 12/05 17:36
14F：推 slimasai:你的anneal和extention時間再加長點試試看吧 12/05 20:03