作者anneychang (anney)
看板Biotech
标题[求救] 用Turbo pfu PCR 做不出来...
时间Tue Dec 2 18:55:53 2008
各位前辈好
我是大三的进实验室的研究生
这几天以来我用Turbo pfu polymerase 做pcr却一直没有东西
我需要的DNA片段是1.2Kb的大小而且跑完电泳照胶确认後是完全没东西
只有一堆的primer在下方而已...
我爲了确认是不是primer或是DNA template的问题
所以用另外一个polymerase (go-taq)来做而可以p出一段1.2kb的DNA
其他像是dNTP的浓度或是extention的时间等等的问题也都按照建议的条件去做
我的pcr condition 是:
preheat 94度 2min template 0.5 ul
denaturation 94度 40s ← primer F 0.3 ul
annealing 50度 1min ∣31 cycles primer R 0.3 ul
extention 72度 2'30s — dNTP 10mM 0.5 ul
extra extention 72度 3min 10X buffer 2.5 ul
10度 pause PFU 0.3 ul
ddH2O 20.6 ul
total 体积是25ul
我另外也有上网查资料
有看到turbo pfu polymerase 的温度条件最低限制是50度
刚好我的annealing的温度就是50度
请问pcr做不出来会是因为这个原因吗?
还是是有其他一些我没有注意到的地方呢?
请有经验的人或是专家可以帮我解答吗?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.100.234
1F：推 alaric:实验室 有学长姊及老师, 不然问厂商吧.. 12/02 19:17
2F：推 jsi:以前使用turbo发现适合的annnealing temp可能会跟其他taq不同 12/02 21:25
3F：→ jsi:可尝试调整一下温度 btw,您的turbo pfu确定有活性吗? 12/02 21:27
4F：推 itoya:不知道你是用strategen的pfu turbo吗?可以尝试extention用 12/02 23:54
5F：→ itoya:68度,记得trouble shooting有这个建议,我也尝试过,有改善! 12/02 23:55
6F：推 slimasai:你的plasmid多大 12/03 23:54
7F：→ slimasai:打错 是要问vector 12/03 23:54
8F：推 lucidol:template浓度?我有做过case是anneal temp我48度都ok 12/04 18:50
9F：→ anneychang:我的template是细菌的chromosome,浓度大是两百多ng/ul 12/05 17:30
10F：→ anneychang:然後现在奇怪的是我有4条primer,F1跟R1;F2跟R2 12/05 17:32
11F：→ anneychang:我用F1跟R2 P不出 1.2kb大小的片段,可是用F1,R1 12/05 17:34
12F：→ anneychang:F2跟R2 可以各自P出约500bp的片段,现在就是卡在P不出我 12/05 17:35
13F：→ anneychang:想要的那一段F1,R2夹出的1.2kb的片段 12/05 17:36
14F：推 slimasai:你的anneal和extention时间再加长点试试看吧 12/05 20:03