※ 引述《[email protected] (蓄勢待發)》之銘言： > 我針對一個his tag蛋白質進行純化 > 但是專一性不夠高 > 我要用來提供廠商當bait純化抗體 其實我第一個不懂的是拿這個來純化抗體的話 為何還要把他從 hist binding column 上 elute 下來？ 不是直接 on column crosslink 就好？ （當然，我不知道你的廠商是怎麼作啦。我以前連抗體純化都是自己做） > 所以需要非常純的蛋白質 其實你想想用 antigen 去純化抗體的原理就知道 當作 bait 的 protein 雖然是越純越好， 但是其實也只需要是 "純化前的抗體會 nonspecifically binding 的 protein 的濃度相對的低" 就可以了 以一般血清形式的抗體來說 跟你當初拿去打兔子／老鼠的 protein/peptide 差不多品質的 protein/peptide 就可以很有效的提升抗體的 specificity 了 > 請問我現在純化出來的蛋白質可以再拿來通column嗎？ > -這些蛋白質是溶在elution buffer裡面（high imidazole） > 我想到兩個方法 > 1.將純化出來的蛋白質做透析換buffer 不管是重跑一次 column 還是從頭重抽一次 protein 你這次作的結果不夠好 照樣在作一次為什麼會更好呢？ > 2.重新作可怕的破菌 > 然後跟別人借機器用不同濃度的imidazole將蛋白質elute出來 那個用手作就可了 其實既然你對產物的純度要求那麼高，一開始就應該這樣做 > 不知道還有沒有其他可以提高專一性的方法？？？ 我比較傾向贊同 ptt 板友推文說的用其他方法再次純化 如果你的產物中非專一性的其他 protein 的分子量跟你要收的差很多 可以跑 gel filtration 或是從 sds page 中切 band, elute 出來 -- 莫非定律: 到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上 補充定律: 拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考 -- ※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> ◆ From: nomad202-174.d.umn.edu