※ 引述《[email protected] (蓄势待发)》之铭言： > 我针对一个his tag蛋白质进行纯化 > 但是专一性不够高 > 我要用来提供厂商当bait纯化抗体 其实我第一个不懂的是拿这个来纯化抗体的话 为何还要把他从 hist binding column 上 elute 下来？ 不是直接 on column crosslink 就好？ （当然，我不知道你的厂商是怎麽作啦。我以前连抗体纯化都是自己做） > 所以需要非常纯的蛋白质 其实你想想用 antigen 去纯化抗体的原理就知道 当作 bait 的 protein 虽然是越纯越好， 但是其实也只需要是 "纯化前的抗体会 nonspecifically binding 的 protein 的浓度相对的低" 就可以了 以一般血清形式的抗体来说 跟你当初拿去打兔子／老鼠的 protein/peptide 差不多品质的 protein/peptide 就可以很有效的提升抗体的 specificity 了 > 请问我现在纯化出来的蛋白质可以再拿来通column吗？ > -这些蛋白质是溶在elution buffer里面（high imidazole） > 我想到两个方法 > 1.将纯化出来的蛋白质做透析换buffer 不管是重跑一次 column 还是从头重抽一次 protein 你这次作的结果不够好 照样在作一次为什麽会更好呢？ > 2.重新作可怕的破菌 > 然後跟别人借机器用不同浓度的imidazole将蛋白质elute出来 那个用手作就可了 其实既然你对产物的纯度要求那麽高，一开始就应该这样做 > 不知道还有没有其他可以提高专一性的方法？？？ 我比较倾向赞同 ptt 板友推文说的用其他方法再次纯化 如果你的产物中非专一性的其他 protein 的分子量跟你要收的差很多 可以跑 gel filtration 或是从 sds page 中切 band, elute 出来 -- 莫非定律: 到了期末才会想起期初曾选了一门课却一直没去上 补充定律: 拿到成绩单才发现上了一学期的课忘了去考期末考 -- ※ Origin: 生命科学 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> ◆ From: nomad202-174.d.umn.edu