作者tsk (:~)
看板Biotech
標題[求救] 請大哥大姊們救救小弟的western blot~
時間Fri Nov 21 18:25:47 2008
今天做western呀~
結果出現很奇怪的情形
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=TskTsk&b=17&f=1951389491&p=0
像這樣
應該要出來的band竟然反白了@@?
右邊的直反白是marker 也很怪 囧
我的實驗步驟是用15%的separating gel
protein濃度是50ng/well (positive control)紅色圈起來的地方
250ng/well (samples)黃色大驚的地方
*
stacking gel用80V跑
接下來用120V跑膠
target protein大約是5.8kDa 不大
接下來transfer 90V 3小時
blocking 在5% non-fat milk overnight
1抗hybrid overnight
wash
2抗hybrid 2~3小時
wash
ECL呈色
結果就哭哭了 嗚嗚嗚
*這裡濃度好像有點低
不知道是不是因為這個才反白 囧?
就煩請板上先進們幫忙解惑吧~~~感謝大家~~~
ps. 用的是PALL的flourotrans W transfer membrane
ps2. 抗體是自己做兔子polyclonal antibody得到的血清抗體 會是抗體出問題嗎?
不過之前也做過 沒出現這種情形說@@ (只是也沒跑出band就是了XD)
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.84.185
1F：推 tsubasawolfy:我覺得是濃度太高訊號過強造成底片過曝- - 11/21 18:34
2F：推 nixo:一抗或二抗稀釋看看。因為ECL被快速消耗掉也可能造成反白。 11/21 19:24
3F：推 tsk:囧 原來濃度是過高@@ 我1抗是用血清10000x稀釋 2抗5000x 11/21 19:46
4F：推 jsi:二抗太濃了 11/21 23:38
5F：推 EsMirada:同意1F..訊號太強 建議稀釋抗體濃度 另外壓片時間縮短 11/22 01:35
6F：推 tsk:好的好的 我這就去重新做一次試試^^ 謝謝各位先進 11/22 18:49
※ 編輯: tsk 來自: 140.112.84.124 (11/24 12:08)
7F：推 phyton:protein 放少一點才是啊 11/27 17:48