作者tsk (:~)
看板Biotech
标题[求救] 请大哥大姊们救救小弟的western blot~
时间Fri Nov 21 18:25:47 2008
今天做western呀~
结果出现很奇怪的情形
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=TskTsk&b=17&f=1951389491&p=0
像这样
应该要出来的band竟然反白了@@?
右边的直反白是marker 也很怪 囧
我的实验步骤是用15%的separating gel
protein浓度是50ng/well (positive control)红色圈起来的地方
250ng/well (samples)黄色大惊的地方
*
stacking gel用80V跑
接下来用120V跑胶
target protein大约是5.8kDa 不大
接下来transfer 90V 3小时
blocking 在5% non-fat milk overnight
1抗hybrid overnight
wash
2抗hybrid 2~3小时
wash
ECL呈色
结果就哭哭了 呜呜呜
*这里浓度好像有点低
不知道是不是因为这个才反白 囧?
就烦请板上先进们帮忙解惑吧~~~感谢大家~~~
ps. 用的是PALL的flourotrans W transfer membrane
ps2. 抗体是自己做兔子polyclonal antibody得到的血清抗体 会是抗体出问题吗?
不过之前也做过 没出现这种情形说@@ (只是也没跑出band就是了XD)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.84.185
1F：推 tsubasawolfy:我觉得是浓度太高讯号过强造成底片过曝- - 11/21 18:34
2F：推 nixo:一抗或二抗稀释看看。因为ECL被快速消耗掉也可能造成反白。 11/21 19:24
3F：推 tsk:囧 原来浓度是过高@@ 我1抗是用血清10000x稀释 2抗5000x 11/21 19:46
4F：推 jsi:二抗太浓了 11/21 23:38
5F：推 EsMirada:同意1F..讯号太强 建议稀释抗体浓度 另外压片时间缩短 11/22 01:35
6F：推 tsk:好的好的 我这就去重新做一次试试^^ 谢谢各位先进 11/22 18:49
※ 编辑: tsk 来自: 140.112.84.124 (11/24 12:08)
7F：推 phyton:protein 放少一点才是啊 11/27 17:48