作者hawksbill (蛙哈哈)
看板Biotech
標題[求救] PCR P大片段一直失敗
時間Wed Nov 19 15:56:03 2008
DNA template是plasmid上的一段insert (有頭尾定序過)
RE cutting site和之後要乘載的vector不能配合
所以設計成兩端翹尾巴
含有RE cutting site的primer 用來夾cDNA
Forward: AAT TTA
GGA TCC ATT
ATG GAG GGC GCC GGC GGC GC
Tm:72 GC%:60
Reverse: TAA ATT
GGA TCC TCA
TCA GTT AAC TTG ATC CAA AG
Tm:62 GC%:34.29
Primer設計在這個基因的ATG與TGA附近
與cDNA互補的序列 是照抄定序結果(與data base查到的相同)
命中注定 一堆GC...... 另一條卻沒有太多GC
Forward primer的部分也沒辦法改
這個gene的ATG前面 居然有個TGA
不把這個TGA弄掉的話 後續我要做C-terminal的Flag fusion就甭做了 @@
於是在這個詭異的條件下 我還是拿去跑PCR
第一次:
95度10min [95度30sec 55度30sec 72度1min]x25 72度10min 25度收尾
結果 一片空白 只有看到vector的band
taq: invitrogen買的
第二次:
95度10min [95度1min 55度1min 72度1min]x25 72度10min 25度收尾
結果 只看到100 bp底下有一團霧霧的 只看見Vector的band
taq: invitrogen買的 或者 Promega買的Gotaq master mix
第三次:
95度10min [95度1min 50度1min 72度3.5min]x25 72度10min 25度收尾
還另外多做一管 有加DMSO (1 ul in 25 ul)
結果 在沒有加DMSO這組 多出一條400 bp的band 只有Invitrogen這牌有做出
taq: invitrogen買的 或者 Promega買的Gotaq master mix
我的PCR product size應該有2.5 Kb 但是卻總看不到一點點產物
希望有處理過類似情況的人 幫我想想辦法
有缺列出的condition 我會隨時來看推文 並且補上資訊
有任何建議 我都會去做做看 死馬當活馬醫 先謝謝大家的幫忙
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◆ From: 140.116.60.214
※ 編輯: hawksbill 來自: 140.116.60.214 (11/19 16:02)
1F：推 sGoat:95度 30 sec 60度 30 sec 72度2.5min]x30~35 試試看 11/19 16:33
2F：→ sGoat:另外要表現的話還是建議用Pfu來PCR,Taq還是會有錯 11/19 16:34
3F：推 sGoat:忘了說你vector好像加太多,200~500 ng即可 11/19 16:37
4F：→ hawksbill:謝謝 等等來跑跑看 11/19 19:21
5F：推 asimpleton:Pfu的話我用過P大約5K的片段 P不出來...> < 11/19 21:13
6F：→ asimpleton:但是我用Long PCR taq就可以成功p出來而且沒有錯誤 11/19 21:13
7F：推 micocat:forward primer 非常容易形成dimer哦 11/19 21:18
8F：推 nixo:需要proof reading又要做長片段，用Phusion比較合適。 11/19 21:20
9F：→ hawksbill:先拿其中一組建議的再測試中 謝謝大家的建議 11/19 21:37
10F：→ hawksbill:死馬當活馬醫了 天曉得這個Gene幹嘛一堆GC....... 11/19 21:38
11F：→ hawksbill:手邊借的到的polymerase如果都失敗 再去買高級品 ^^a 11/19 21:38
12F：→ hawksbill:回報消息 感謝鄉民們的建議 我用了touchdown PCR的方法 11/20 06:36
13F：→ hawksbill:目前至少有做出正確大小的片段了 繼續往下一步邁進 11/20 06:36
14F：→ hawksbill:感謝大家... 以後又卡關的話 再來問 ^^ 11/20 06:36
15F：推 zeroIII:可以借問一下~那touchdown請問你設怎樣阿~我跟原PO有類似 11/21 23:58
16F：→ zeroIII:的問題,一樣forward 有一堆GC, 可以借我參考一下嗎~3Q 11/21 23:59
17F：→ hawksbill:94 2min --> 94 30sec 72 1min (5 cycle)--> 11/22 05:28
18F：→ hawksbill:94 30s 70 1min (5 cycle)--> 11/22 05:28
19F：→ hawksbill:94 30s 50 1min 72 1min (25 cycle) 11/22 05:28
20F：→ hawksbill:-> 72 10min --> 25 forever 11/22 05:29
21F：→ hawksbill:這是好心人建議我的參數 有做出來 ^^ 11/22 05:29