作者hawksbill (蛙哈哈)
看板Biotech
标题[求救] PCR P大片段一直失败
时间Wed Nov 19 15:56:03 2008
DNA template是plasmid上的一段insert (有头尾定序过)
RE cutting site和之後要乘载的vector不能配合
所以设计成两端翘尾巴
含有RE cutting site的primer 用来夹cDNA
Forward: AAT TTA
GGA TCC ATT
ATG GAG GGC GCC GGC GGC GC
Tm:72 GC%:60
Reverse: TAA ATT
GGA TCC TCA
TCA GTT AAC TTG ATC CAA AG
Tm:62 GC%:34.29
Primer设计在这个基因的ATG与TGA附近
与cDNA互补的序列 是照抄定序结果(与data base查到的相同)
命中注定 一堆GC...... 另一条却没有太多GC
Forward primer的部分也没办法改
这个gene的ATG前面 居然有个TGA
不把这个TGA弄掉的话 後续我要做C-terminal的Flag fusion就甭做了 @@
於是在这个诡异的条件下 我还是拿去跑PCR
第一次:
95度10min [95度30sec 55度30sec 72度1min]x25 72度10min 25度收尾
结果 一片空白 只有看到vector的band
taq: invitrogen买的
第二次:
95度10min [95度1min 55度1min 72度1min]x25 72度10min 25度收尾
结果 只看到100 bp底下有一团雾雾的 只看见Vector的band
taq: invitrogen买的 或者 Promega买的Gotaq master mix
第三次:
95度10min [95度1min 50度1min 72度3.5min]x25 72度10min 25度收尾
还另外多做一管 有加DMSO (1 ul in 25 ul)
结果 在没有加DMSO这组 多出一条400 bp的band 只有Invitrogen这牌有做出
taq: invitrogen买的 或者 Promega买的Gotaq master mix
我的PCR product size应该有2.5 Kb 但是却总看不到一点点产物
希望有处理过类似情况的人 帮我想想办法
有缺列出的condition 我会随时来看推文 并且补上资讯
有任何建议 我都会去做做看 死马当活马医 先谢谢大家的帮忙
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.60.214
※ 编辑: hawksbill 来自: 140.116.60.214 (11/19 16:02)
1F：推 sGoat:95度 30 sec 60度 30 sec 72度2.5min]x30~35 试试看 11/19 16:33
2F：→ sGoat:另外要表现的话还是建议用Pfu来PCR,Taq还是会有错 11/19 16:34
3F：推 sGoat:忘了说你vector好像加太多,200~500 ng即可 11/19 16:37
4F：→ hawksbill:谢谢 等等来跑跑看 11/19 19:21
5F：推 asimpleton:Pfu的话我用过P大约5K的片段 P不出来...> < 11/19 21:13
6F：→ asimpleton:但是我用Long PCR taq就可以成功p出来而且没有错误 11/19 21:13
7F：推 micocat:forward primer 非常容易形成dimer哦 11/19 21:18
8F：推 nixo:需要proof reading又要做长片段，用Phusion比较合适。 11/19 21:20
9F：→ hawksbill:先拿其中一组建议的再测试中 谢谢大家的建议 11/19 21:37
10F：→ hawksbill:死马当活马医了 天晓得这个Gene干嘛一堆GC....... 11/19 21:38
11F：→ hawksbill:手边借的到的polymerase如果都失败 再去买高级品 ^^a 11/19 21:38
12F：→ hawksbill:回报消息 感谢乡民们的建议 我用了touchdown PCR的方法 11/20 06:36
13F：→ hawksbill:目前至少有做出正确大小的片段了 继续往下一步迈进 11/20 06:36
14F：→ hawksbill:感谢大家... 以後又卡关的话 再来问 ^^ 11/20 06:36
15F：推 zeroIII:可以借问一下~那touchdown请问你设怎样阿~我跟原PO有类似 11/21 23:58
16F：→ zeroIII:的问题,一样forward 有一堆GC, 可以借我参考一下吗~3Q 11/21 23:59
17F：→ hawksbill:94 2min --> 94 30sec 72 1min (5 cycle)--> 11/22 05:28
18F：→ hawksbill:94 30s 70 1min (5 cycle)--> 11/22 05:28
19F：→ hawksbill:94 30s 50 1min 72 1min (25 cycle) 11/22 05:28
20F：→ hawksbill:-> 72 10min --> 25 forever 11/22 05:29
21F：→ hawksbill:这是好心人建议我的参数 有做出来 ^^ 11/22 05:29