作者sleepyday (秋天又來啦~~~)
看板Biotech
標題[求救] Primer前未加flanking base的話,BamHI切得動嗎?
時間Sat Nov 15 16:53:57 2008
一般來說,在設計primer的時候通常都會在限制酶切位外多加1~3個flanking bases,
來讓restriction enzyme可以辨識到,
就像這樣:
5' cgc
GGATCC......3'
(前面的那3個bases)
那我想請問,如果沒有加flanking bases,
那麼在PCR後,產物可以被BamHI切的動嗎?
我的目的是要把兩段fragments
(seq A & seq B)連起來,中間的連接點是BamHI,
這兩段序列分別是:
seq A: HindIII---
seq A---BamHI
seq B: BamHI---
seq B---EcoRV
想要連成:
HindIII---
seq A---BamHI---
seq B---EcoRV
但我手邊現有的primer是別人設計好的,不過他沒在前面多加bases.
而我的策略是先用PCR把這兩段序列用P出來,然後用BamHI處理、做ligation,
之後再用A的FP和B的RP來放大全段,再塞進vector.
但這幾次做都無法P出全段序列,所以想問問是否問題是在primer沒加flanking bases?
如果是的話,可能我就要重訂primer了.
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.64.144.235
1F：→ sGoat:不用重訂,PCR完接個vector再用Bam HI切再ligation接下去作 11/15 17:02
2F：→ sGoat:沒加flanking bases RE是黏不上的 11/15 17:04
3F：推 konlon:TA-cloning is a good choice 11/15 18:18
4F：推 beowulfo:先clone到cloning vector再進行subclone 11/15 18:28