作者sleepyday (秋天又来啦~~~)
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标题[求救] Primer前未加flanking base的话,BamHI切得动吗?
时间Sat Nov 15 16:53:57 2008
一般来说,在设计primer的时候通常都会在限制酶切位外多加1~3个flanking bases,
来让restriction enzyme可以辨识到,
就像这样:
5' cgc
GGATCC......3'
(前面的那3个bases)
那我想请问,如果没有加flanking bases,
那麽在PCR後,产物可以被BamHI切的动吗?
我的目的是要把两段fragments
(seq A & seq B)连起来,中间的连接点是BamHI,
这两段序列分别是:
seq A: HindIII---
seq A---BamHI
seq B: BamHI---
seq B---EcoRV
想要连成:
HindIII---
seq A---BamHI---
seq B---EcoRV
但我手边现有的primer是别人设计好的,不过他没在前面多加bases.
而我的策略是先用PCR把这两段序列用P出来,然後用BamHI处理、做ligation,
之後再用A的FP和B的RP来放大全段,再塞进vector.
但这几次做都无法P出全段序列,所以想问问是否问题是在primer没加flanking bases?
如果是的话,可能我就要重订primer了.
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◆ From: 61.64.144.235
1F：→ sGoat:不用重订,PCR完接个vector再用Bam HI切再ligation接下去作 11/15 17:02
2F：→ sGoat:没加flanking bases RE是黏不上的 11/15 17:04
3F：推 konlon:TA-cloning is a good choice 11/15 18:18
4F：推 beowulfo:先clone到cloning vector再进行subclone 11/15 18:28