作者homer0331 (Homer)
站內Biotech
標題[求救] Real-time
時間Thu Nov 13 15:15:55 2008
最近做 real-time 有很多的問題
之前primer設計了很多次
專一性都會不太好
好不容易梯度都測好了
做普通ＰＣＲ看起來的都ＯＫ
但是做real 時候都會有很多條峰
而且負ctrl也會有 band
我是用Bio-Rad SYBR 總體積 25 :
包含 SYBR 12.5, H2O(nuclease free)6.5, primer 0.5(total conc. 200nm)
, template 5ul(用1ug RNA轉)
還有我有時候會加betaine讓ＰＣＲ好一點
這可以加入SYBR Green嗎
另外一個問題就是圖型的問題
如果同一sample和同樣primer做出來的圖
Ct值一樣
但是過Ct 值後爬升的高度不一樣
那是甚麼問題呢
最後就是做的時候
SYBR都會有很多泡泡
離也離不掉
但是都是在很上層
如果只有一個泡泡也會有差嗎
大家都怎麼操作比較不會有泡泡
謝謝大家幫我解答
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◆ From: 140.121.179.203
1F：推 zoom8080:跑完應該沒泡泡 因為94 95度泡泡會破 11/13 16:24
2F：→ zoom8080:primer直接找paper會比較快，不過有時連paper的都有dimer 11/13 16:25
3F：→ zoom8080:template 5ul是每well 5ul嗎? 11/13 16:27
4F：→ zoom8080:PCR看產物本來就有風險 因為副產物量不多肉眼看不見 11/13 16:28
5F：→ zoom8080:(指透過跑膠看不見) 11/13 16:29
6F：推 zoom8080:機器用哪一台? 11/13 16:34
7F：→ homer0331:iq cycler 11/13 21:31